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Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:58 min • July 8th, 2025
Prendete una sezione fissa del cervello di topo contenente il nucleo basale di Meynert, ricco di fibre nervose che esprimono l'enzima colina acetiltransferasi.
La sezione viene pretrattata per disattivare la perossidasi endogena.
Aggiungere un detergente per permeabilizzare le membrane cellulari, seguito da una soluzione bloccante per prevenire il legame di anticorpi non specifici.
Sostituire la soluzione con anticorpi primari che si legano alla colina acetiltransferasi.
Lavare con tampone per rimuovere gli anticorpi non legati. Incubare con anticorpi secondari marcati con biotina, che si legano agli anticorpi primari.
Rimuovere gli anticorpi non legati e aggiungere i complessi avidina-biotina-perossidasi, che si legano agli anticorpi secondari.
Lavare per rimuovere i complessi in eccesso.
Aggiungere un substrato cromogenico che reagisce con la perossidasi, formando un precipitato colorato.
Sciacquare con acqua distillata per rimuovere il precipitato in eccesso.
Trasferire la sezione su un vetrino gelatinizzato.
Successivamente, disidratare la sezione utilizzando concentrazioni crescenti di etanolo, seguite da xilene.
Montare la sezione e osservare al microscopio per visualizzare le fibre nervose colorate.
Per la marcatura immunoistochimica delle sezioni di tessuto, dopo aver bloccato qualsiasi legame aspecifico con il 10% di siero bovino normale in Triton X-100 allo 0,1%, in soluzione salina tris-tamponata, marcare le sezioni con l'anticorpo primario di interesse, per 48 ore a quattro gradi Celsius.
Al termine dell'incubazione, lavare le sezioni tre volte, per tre minuti, in soluzione salina fresca tris-tamponata per lavaggio. Seguito da incubazione con un anticorpo secondario biotinilato appropriato, per un'ora a temperatura ambiente.
Al termine dell'incubazione, lavare le sezioni tre volte in soluzione salina fresca tris-tamponata, come dimostrato. Seguito da colorazione con complesso avidina-biotina-perossidasi e soluzione di substrato DAB perossidasi, secondo i protocolli del produttore.
Dopo il lavaggio, montare tutte le sezioni da un campione di tessuto cerebrale su un vetrino gelatinizzato. Lasciare asciugare i campioni all'aria. Per disidratare le sezioni, immergere i campioni due volte, per cinque minuti per diluizione, in soluzioni di etanolo ascendenti sequenziali, come indicato, seguite da chiarificazione con due lavaggi di xilene di 10 minuti. Quindi, utilizzare un mezzo di montaggio appropriato per posizionare i vetrini coprioggetti sui vetrini.