Misurazione dell'assorbimento della dopamina nei sinaptosomi cerebrali di topo utilizzando la dopamina radiomarcata

Raccogliere sinaptosomi, strutture legate alla membrana derivate dai terminali presinaptici intatti delle sinapsi neuronali che contengono trasportatori della dopamina (DAT), da un cervello di topo.

Riempire le provette con tampone contenente ligandi e le provette di riferimento con tampone contenente ligandi e un inibitore DAT.

Aggiungi i sinaptosomi.

I ligandi inibiscono gli enzimi che degradano la dopamina e altri trasportatori, impedendo la degradazione della dopamina e l'assorbimento aspecifico.

Introdurre dopamina non marcata e radiomarcata.

Nella condizione di test, il DAT sinaptosomiale assorbe la dopamina.

Nella condizione di riferimento, l'inibitore impedisce l'assorbimento della dopamina mediato da DAT, consentendo solo l'assorbimento di fondo.

Aggiungere i campioni a filtri in microfibra che trattengono i sinaptosomi.

Lavare per rimuovere la dopamina non legata.

Trasferire i filtri in tubi a scintillazione.

Aggiungere liquido di scintillazione contenente un composto radiosensibile.

Posizionare i tubi in un contatore di scintillazione.

Le emissioni radioattive della dopamina eccitano il composto a emettere luce, che viene misurata dal contatore.

Sottrarre il riferimento dai dati del test per misurare l'assorbimento sinaptosomiale della dopamina.

In questa fase, aggiungere 440 microlitri di tampone di assorbimento, ligando e cocaina a 12 provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri designate e 440 microlitri di tampone di assorbimento e ligando alle restanti 36 provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Etichettare 6 provette per microcentrifuga da 2 millilitri come 10, 5, 2,5, 1,25, 0,62 e 0,31. Quindi aggiungere 750 microlitri di tampone di captazione e ligando alle 5 provette per microcentrifuga con il numero più basso.

Successivamente, aggiungere 1.455,4 microlitri di tampone di captazione e ligando, 14,6 microlitri di dopamina non marcata e 30 microlitri di dopamina triziata alla provetta etichettata 10. Quindi, trasferire 750 microlitri di miscela dal tubo etichettato 10 al tubo etichettato 5. Mescolare bene e trasferire 750 microlitri di miscela da questo tubo al tubo etichettato 2.5. Ripetere questa diluizione con le provette rimanenti.

Successivamente, pre-sciacquare i filtri in microfibra di vetro con 4 millilitri di tampone di assorbimento dopo averli posizionati su un secchio filtrante a 12 pozzetti. Successivamente, aggiungere 10 microlitri della sospensione di membrana sinaptosomiale alle prime 24 provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri contenenti 440 microlitri di tampone. Agitare con attenzione e ruotare brevemente per assicurarsi che i sinaptosomi siano immersi nel tampone.

Quindi, lasciali a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo 10 minuti, aggiungere 50 microlitri di dopamina di 10 micromolari e 5 micromolari alle prime 2 colonne e lasciarle a 37 gradi Celsius per 5 minuti agitando. Dopo 5 minuti, interrompere la reazione aggiungendo 1 millilitro di tampone di assorbimento ghiacciato. Ripeti con il micromolare da 2,5 e il micromolare da 1,25, e poi con il micromolare da 0,62 e il micromolare da 0,31.

Aggiungere i campioni ai filtri in microfibra pre-risciacquati e lavarli con 5 x 4 millilitri di tampone di assorbimento a freddo ghiacciato. Dopo che i primi 12 campioni sono stati aggiunti ai filtri, spostare i filtri sui tubi di scintillazione. Ripeti l'operazione con i prossimi 12 campioni. Preparare 3 provette di conteggio max posizionando un filtro in microfibra sul fondo delle provette a scintillazione da 49 a 51 e aggiungendo 25 microlitri della dopamina massima di 10 micromolari sulla parte superiore.

Successivamente, lasciare tutti i 51 tubi di scintillazione in una cappa aspirante per 1 ora. Quindi, aggiungere 3 millilitri di fluido di scintillazione a ciascun tubo di scintillazione e agitare energicamente su uno shaker per 1 ora. Per contare la dopamina triziata in un contatore beta per 1 minuto, aprire il programma e scegliere le impostazioni adatte. Per la determinazione delle proteine, utilizzare un kit standard per il dosaggio delle proteine BCA per determinare le concentrazioni proteiche dei sinaptosomi per gli aggiustamenti e per un corretto confronto dell'assorbimento tra i campioni.