Marcatura di interneuroni riempiti di biocitina in fette di ippocampo di ratto per la visualizzazione

Prendi fette di ippocampo di ratto fisse e permeabilizzate contenenti interneuroni pieni di biocitina con perossidasi endogene inattivate.

Aggiungere complessi avidina-biotina (ABC) contenenti perossidasi di rafano (HRP) e incubare, consentendo all'avidina di legarsi alla biocitina.

Lavare via l'ABC non legato.

Aggiungere una miscela di substrato cromogenico e potenziatore di metalli, quindi incubare.

Introdurre il perossido di idrogeno per attivare l'HRP, che ossida il substrato per formare un precipitato scuro, mentre l'enhancer migliora il contrasto.

Trasferire le fette su carta da filtro e rimuovere il tampone in eccesso. Trattare con tetrossido di osmio per migliorare il contrasto.

Posizionare le fette su un vetrino e montarle. Disidratarli aumentando le concentrazioni di etanolo.

Lavate le fette in etanolo assoluto e ossido di propilene.

Aggiungere la resina per infiltrare i tessuti.

Metti le fette in una planchette e scalda per polimerizzare la resina. Trasferire le fette su un vetrino, posizionare un vetrino coprioggetti e solidificare la resina.

Utilizzando la microscopia ottica, visualizza gli interneuroni pieni di biocitina colorati in modo scuro.

Mettere le sezioni in un flaconcino di vetro pulito contenente PBS. Eseguire la reazione avidina HRP incubando prima le sezioni nel complesso avidina biotina, o ABC, per almeno due ore per amplificare il prodotto della reazione HRP.

Successivamente, lavare le sezioni con PBS 3 volte per 10 minuti, quindi con Tris buffer due volte per 10 minuti. Dopo aver rimosso l'ultimo lavaggio del tampone in tracce, aggiungere rapidamente 1 goccia di soluzione di cloruro di nichel all'8% alla soluzione di diaminobenzidina o alla soluzione DAB. Quindi pipettare la soluzione dentro e fuori per mescolare.

E aggiungi rapidamente 1 millilitro di questa soluzione sulle sezioni. Incubare le sezioni in questa soluzione per 15 minuti. Quindi, aggiungere 10 microlitri di perossido di idrogeno all'1% alla soluzione DAB. Lasciare che la reazione proceda al buio sotto costante agitazione per circa 1 o 2 minuti, fino a quando le cellule non sono etichettate.

In una cappa aspirante, posizionare un piccolo cerchio di carta da filtro in una capsula di Petri e inumidirlo con PB. Sollevare le sezioni una alla volta dalla fiala di vetro utilizzando un pennello e posizionarle con cura sulla carta. Coprire le sezioni con un altro cerchio inumidito di carta da filtro. E rimuovere il tampone in eccesso toccando delicatamente la superficie della carta velina.

Applicare 8 o 9 gocce di tetrossido di osmio all'1% in PB sulla carta superiore. Coprire la pirofila e conservare nella cappa aspirante per almeno 30 minuti, ma non più di un'ora. Dopo aver risciacquato, montato e coperto le sezioni, disidratare attraverso una serie di soluzioni alcoliche al 50%, 70%, 95% e 100%.

Dopo la fase di disidratazione, trasferire le sezioni in una fiala di vetro contenente etanolo al 100% su uno shaker per circa 5 minuti. Sostituire la soluzione alcolica con l'ossido di propilene e lavare tre volte per 5 minuti. Dopo l'ultimo lavaggio, conservare circa 2 millilitri di ossido di propilene nella fiala e aggiungere la resina in un rapporto di uno a uno.

Assicurarsi che la resina sia disciolta e mantenere le sezioni sotto costante agitazione per 30 minuti. Dopo 30 minuti, utilizzare un bastoncino di legno per posizionare ogni sezione in un tondello di alluminio contenente resina epossidica e incubare per una notte. Il giorno successivo, posizionare il tondello su una piastra calda per circa 10 minuti.

Quindi, raccogli ogni sezione con un bastoncino di legno e posizionala su uno scivolo pulito. Una volta che tutte le sezioni sono state trasferite sul vetrino, visualizzare il vetrino al microscopio da dissezione per verificare l'orientamento delle fette e posizionare un vetrino coprioggetti sulle sezioni. Polimerizzare in forno per 48 ore a 56 gradi Celsius.