Valutazione della compromissione motoria nei modelli di C. elegans utilizzando il saggio di locomozione radiale

Prendiamo le piastre di Petri contenenti una distribuzione uniforme del cibo per vermi sui terreni di crescita dei nematodi.

Capovolgi ogni piatto e segna il centro.

Usando un microscopio, introdurre i vermi Caenorhabditis elegans nel punto contrassegnato centralmente.

Quindi, introdurre vermi di età corrispondente sulle piastre rimanenti.

Questi vermi esprimono le forme wild-type o mutanti di una proteina che lega l'RNA umano, che forma aggregati tossici nel citoplasma neuronale e porta alla morte neuronale.

Ciò riduce la capacità dei vermi di controllare i movimenti muscolari, con conseguente compromissione della funzione motoria.

Consenti ai vermi di strisciare per un determinato periodo.

Usando un microscopio, segna la posizione finale di ogni verme.

Misurare la distanza radiale percorsa dalle viti senza fine dal punto centrale alle loro posizioni finali.

Rispetto ai controlli, i vermi che esprimono livelli più bassi della proteina wild-type mostrano una lieve compromissione motoria, quelli con livelli più elevati della proteina wild-type mostrano una compromissione moderata e quelli con la proteina mutante mostrano una grave compromissione.

Capovolgere le piastre del saggio NGM ed etichettare il fondo con un identificatore per i ceppi di C. elegans da analizzare. Fai un piccolo punto con il pennarello al centro del piatto capovolto. Mentre si lavora con un microscopio da dissezione, trasferire i vermi al centro della piastra del saggio e impostare un timer per 30 minuti. Rimetti il coperchio sul piatto e mettilo da parte. Continuare a trasferire i vermi fino a quando tutti i ceppi non si trovano sulle piastre di analisi designate.

Dopo 30 minuti, iniziare a incidere la prima piastra rimuovendo il coperchio e posizionando la piastra a faccia in giù sotto il microscopio da dissezione. Regolare la messa a fuoco del microscopio fino a quando tutti i vermi sono visibili attraverso l'agar. Usando un pennarello di colore diverso dal punto centrale, metti un piccolo punto nella posizione di ogni verme.

Controlla il bordo del piatto, poiché alcuni vermi potrebbero finire lì. Inoltre, conta e registra quanti vermi non si sono spostati dal punto centrale. Misura la distanza dal punto centrale ai segni di posizione finale per ogni verme e registra la distanza usando un righello. Il primo punto del verme è contrassegnato da un trattino. Registra i dati di lunghezza per ogni punto consecutivamente ruotando la piastra in senso orario.