Ibridazione in situ mediante sonde oligonucleotidiche per studiare l'espressione dell'RNA in sezioni cerebrali di ratto

Prendiamo sezioni fisse del cervello da un ratto con sindrome serotoninergica, che porta a un'alterata sintesi dell'RNA del recettore della serotonina nei neuroni.

Disidratare il tessuto usando l'alcol. Applicare una soluzione di pretrattamento per disattivare gli enzimi idrolizzanti endogeni, prevenendo la loro interazione con i reagenti di rilevamento.

Trattare con un tampone bollente per rompere i legami incrociati indotti dalla fissazione, esponendo gli RNA bersaglio.

Disidratare il tessuto, disegnare una barriera idrofobica e incubarlo con una soluzione per permeabilizzare le membrane cellulari.

Aggiungere sonde oligonucleotidiche e incubare, consentendo alle sonde di ibridarsi con gli RNA bersaglio.

Lavare per rimuovere le sonde non legate, quindi incubare con reagenti di amplificazione contenenti sonde di preamplificazione, amplificatore e sonde di etichette coniugate con enzimi che si legano alle sonde oligonucleotidiche.

Incubare con substrati cromogenici che vengono idrolizzati dalle sonde coniugate con enzimi, producendo un colore visibile.

Trattare con xilene per aumentare la trasparenza dei tessuti, aggiungere un mezzo di montaggio e applicare un vetrino coprioggetti.