Ibridazione in situ mediante sonde oligonucleotidiche per studiare l'espressione dell'RNA in sezioni cerebrali di ratto

Prendiamo sezioni fisse del cervello da un ratto con sindrome serotoninergica, che porta a un'alterata sintesi dell'RNA del recettore della serotonina nei neuroni.

Disidratare il tessuto usando l'alcol. Applicare una soluzione di pretrattamento per disattivare gli enzimi idrolizzanti endogeni, prevenendo la loro interazione con i reagenti di rilevamento.

Trattare con un tampone bollente per rompere i legami incrociati indotti dalla fissazione, esponendo gli RNA bersaglio.

Disidratare il tessuto, disegnare una barriera idrofobica e incubarlo con una soluzione per permeabilizzare le membrane cellulari.

Aggiungere sonde oligonucleotidiche e incubare, consentendo alle sonde di ibridarsi con gli RNA bersaglio.

Lavare per rimuovere le sonde non legate, quindi incubare con reagenti di amplificazione contenenti sonde di preamplificazione, amplificatore e sonde di etichette coniugate con enzimi che si legano alle sonde oligonucleotidiche.

Incubare con substrati cromogenici che vengono idrolizzati dalle sonde coniugate con enzimi, producendo un colore visibile.

Trattare con xilene per aumentare la trasparenza dei tessuti, aggiungere un mezzo di montaggio e applicare un vetrino coprioggetti.

Al microscopio, le macchie colorate nel tessuto aiutano a quantificare l'espressione dell'RNA bersaglio.

In questa procedura, per la disidratazione, prelevare quattro vetrini per scatole di vetrini da microscopio conservate nel congelatore a 80 gradi Celsius negativi. Assegna le sezioni ai test dei geni ppiB, dapB e ht2a. Segnali ed etichettali con una penna a sfera.

Quindi, immergere i vetrini in alcol al 100% a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, asciugare i vetrini per cinque minuti nella cappa aspirante. Per il pretrattamento, pipettare 20 microlitri di un reagente per ogni sezione.

Posizionare i vetrini su una guida per rack in un vassoio per l'umidità. Agitare delicatamente la vaschetta dell'umidità su uno shaker orizzontale a bassa velocità per 10 minuti. Quindi, lavare i vetrini due volte con acqua distillata doppia per due minuti. Immergere i vetrini in un becher da 1.000 millilitri contenente 450 millilitri del reagente di pretrattamento 2.

Quindi, far bollire i vetrini per un totale di cinque minuti a 100 gradi Celsius per ripristinare la struttura dell'RNA. Successivamente, lavare i vetrini due volte con acqua distillata doppia per due minuti ogni volta. Immergere i vetrini in alcol al 100% per cinque minuti.

Quindi asciugare i vetrini per cinque minuti nella cappa aspirante. Usa una penna idrofobica per disegnare un cerchio attorno all'area selezionata nella sezione del tessuto. Successivamente, pipettare 10 microlitri di reagente di pretrattamento in ciascuna area selezionata per aumentare la penetrazione della sonda e coprire il vassoio dell'umidità con un coperchio.

Successivamente, posizionare la teglia nel forno di ibridazione dotato di agitatore orizzontale. Impostare la temperatura del forno a 40 gradi Celsius e scuotere delicatamente la teglia per 30 minuti. Successivamente, lavare i vetrini due volte con acqua distillata doppia per due minuti ogni volta.

In questa fase, pipettare 10 microlitri di sonda ppiB, dapB o htr2a sulle aree selezionate. Quindi, coprire il vassoio dell'umidità con un coperchio per evitare l'evaporazione del reagente. Agitare delicatamente i vetrini sull'agitatore orizzontale a bassa velocità mentre li incubano a 40 gradi Celsius in forno per due ore.

Quindi, lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per due minuti ogni volta. Pipettare 10 microlitri di reagente di amplificazione su ogni area selezionata. Agitare e incubare i vetrini a 40 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per due minuti ogni volta.

Pipettare 10 microlitri di reagente di amplificazione 2 su ogni area selezionata. Agitare e incubare i vetrini a 40 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per due minuti ogni volta.

Pipettare 10 microlitri del reagente di amplificazione 3 su ogni area selezionata. Agitare e incubare i vetrini a 40 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per due minuti.

Pipettare 10 microlitri del reagente di amplificazione 4 su ogni area selezionata. Agitare e incubare i vetrini a 40 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi, lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per due minuti.

Pipettare 10 microlitri del reagente di amplificazione 5 su ogni area selezionata. Agitare e incubare i vetrini a temperatura ambiente per 30 minuti. Successivamente, lavare due volte i vetrini con un tampone di lavaggio per due minuti.

Pipettare 10 microlitri di reagente di amplificazione 6 su ogni area selezionata. Agitare e incubare i vetrini a temperatura ambiente per 15 minuti. Quindi, lavare nuovamente i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per due minuti ogni volta.

Ora, pipettare 10 microlitri di reagente rosso in ogni area selezionata. Posizionare i vetrini nella vaschetta dell'umidità sull'agitatore orizzontale a temperatura ambiente e agitare delicatamente a bassa velocità per 10 minuti. Quindi, lavare i vetrini due volte con acqua distillata doppia per 10 minuti ogni volta.

Asciugare i vetrini a 60 gradi Celsius in forno per 15 minuti. Successivamente, posizionare i vetrini in xilene nella cappa aspirante per cinque minuti. Quindi, pipettare 20 microlitri di terreno di montaggio a base di xilene su ciascuna area selezionata e coprire con un vetrino coprioggetti.