JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:13 min. • July 8th, 2025
Inizia con una provetta contenente mitocondri di donatori marcati in fluorescenza di colore rosso intenso.
Aggiungere un mezzo di proliferazione freddo per disperdere i mitocondri.
Erogare la soluzione mitocondriale vicino al fondo del pozzetto contenente cellule staminali di glioblastoma modificate o GSC.
Queste cellule tumorali cerebrali modificate sono marcate con un colorante fluorescente blu e contengono mitocondri endogeni marcati con fluorescenza rossa.
La sospensione copre l'intera superficie del pozzo, distribuendo uniformemente i mitocondri.
Centrifugare la piastra di coltura per avvicinare i mitocondri alle cellule per la loro interazione.
Ora, incuba la piastra di coltura.
La membrana cellulare forma grandi vescicole che inghiottono il materiale extracellulare, compresi i mitocondri del donatore.
Le cellule quindi internalizzano queste vescicole, rilasciando i mitocondri del donatore nel loro citoplasma, alterando potenzialmente il metabolismo e le funzioni delle GSC.
Osservare le cellule al microscopio confocale.
Dopo l'analisi dell'immagine, la presenza di cellule blu contenenti mitocondri verdi del donatore insieme a mitocondri endogeni rossi conferma il successo del trasferimento mitocondriale.
Per trasferire i mitocondri isolati delle MSC alle GSC, aggiungere 200 microlitri di terreno di proliferazione delle GSC preraffreddato al pellet mitocondriale. Diluire il preparato mitocondriale nel terreno di proliferazione delle GSC per consentire costantemente l'aggiunta di 20 microlitri di sospensione mitocondriale alle GSC.
Quindi, aggiungi lentamente i mitocondri vicino al fondo del pozzo. Centrifugare le piastre a 1.500 volte G a 4 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi, posizionare immediatamente le colture a 37 gradi Celsius. Infine, eseguire l'analisi del trasferimento dei mitocondri, l'analisi FACS e l'imaging confocale secondo il protocollo di testo.