JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:38 min • July 8th, 2025
Prendi colture cellulari aderenti della cresta neurale cresciute su vetrini coprioggetti rivestiti con idrogel di varia rigidità. Lavare le celle con tampone.
Aggiungere paraformaldeide per fissare le cellule e preservare la morfologia cellulare.
Lavare le celle con tampone per rimuovere l'eccesso di paraformaldeide.
Successivamente, aggiungi un detergente non ionico per permeabilizzare le membrane cellulari.
Lavare le celle con un tampone per rimuovere il detersivo in eccesso.
Quindi, introdurre una soluzione di blocco per impedire l'associazione non specifica.
Incubare le cellule con una sonda di actina filamentosa ad alta affinità che si lega ai filamenti di actina.
Lavare le celle con tampone per rimuovere eventuali sonde non legate.
Aggiungere un colorante nucleare fluorescente per colorare i nuclei, quindi lavare con tampone per rimuovere il colorante in eccesso.
Applicare il terreno di montaggio sui vetrini coprioggetti ed esaminare le cellule colorate al microscopio a fluorescenza.
Le cellule coltivate su idrogel più rigidi mostrano una maggiore formazione di filamenti di actina e una morfologia più diffusa rispetto a quelle coltivate su idrogel più morbidi.
Usa le pinzette per trasportare i vetrini coprioggetti su una nuova piastra per ridurre al minimo i falsi segnali provenienti dalle cellule cresciute direttamente sulla piastra. Quindi, fissare le cellule utilizzando 500 microlitri di paraformaldeide al 4% per 10 minuti, prima di trattare le cellule con 500 microlitri di Triton X-100 allo 0,1% a temperatura ambiente.
Dopo 15 minuti, bloccare le cellule con 250 microlitri di siero d'asina al 10%. Colorare le cellule per la F-actina con falloidina a una diluizione da 1 a 400 in 250 microlitri di siero d'asina al 10%, seguito da incubazione con DAPI per 10 minuti.
Lavare le celle con PBS per due minuti prima di aggiungere tre o quattro gocce di terreno di montaggio a ciascun pozzetto. Su un microscopio a fluorescenza, catturare le immagini di almeno tre fotogrammi casuali per campione di idrogel producendo canali singoli e uniti.