JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 4:11 min. • July 8th, 2025
Mettere le larve di Drosophila di controllo e mutanti in piatti separati contenenti un tampone privo di glucosio.
Sezionare le larve per rimuovere gli organi interni, esponendo il sistema nervoso centrale o il SNC.
Il SNC include un cordone nervoso ventrale che ospita i motoneuroni. Nelle larve mutanti, questi neuroni mostrano un metabolismo del glucosio sovraregolato.
I motoneuroni di entrambi i gruppi esprimono sensori di glucosio intracellulari contenenti fluorofori donatori e accettori.
Posizionare le larve sotto un microscopio confocale. Dopo l'eccitazione, il fluoroforo donatore emette fluorescenza.
Localizza i motoneuroni usando questa fluorescenza.
Sostituire il tampone con una soluzione integrata con glucosio.
Il glucosio entra nei neuroni, legandosi ai sensori e innescando un cambiamento conformazionale che avvicina i due fluorofori.
Dopo l'eccitazione, l'accettore assorbe l'energia emessa dal donatore, chiamata trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza o FRET, ed emette fluorescenza.
Il segnale FRET è correlato all'assorbimento del glucosio. Una maggiore intensità del segnale accettore nelle larve mutanti rispetto al controllo indica un metabolismo del glucosio sovraregolato.
Prima di iniziare le dissezioni, accendere il microscopio per immagini e i laser. Quindi, raccogli una larva errante del terzo stadio. Sciacquarlo con acqua bidistillata e metterlo in una goccia di tampone HL3 su un piatto rivestito in elastomero precedentemente preparato.
Successivamente, sotto un microscopio da dissezione, utilizzare un paio di pinze per bloccare le estremità anteriore e posteriore della larva, con il lato dorsale rivolto verso l'alto, allungando accuratamente la larva nel senso della lunghezza con spilli per insetti. Usando un paio di forbici angolate per l'iride, fai un'incisione appena sopra il perno posteriore. Quindi eseguire un taglio verticale dall'incisione verso l'estremità anteriore della larva.
Dopo aver aggiunto alcune gocce di tampone HL3, se necessario, rimuovere la trachea e il resto degli organi galleggianti senza disturbare il sistema nervoso centrale. Quindi, appuntare i lembi, allungando la parete del corpo, per esporre il sistema nervoso centrale mantenendo intatto il sistema neuromuscolare.
Per l'acquisizione delle immagini, utilizzare un microscopio confocale verticale con una lente a immersione in acqua 40x. Quindi, seleziona il laser a 405 nanometri per eccitare la CFP. Successivamente, ottimizza i parametri di acquisizione, come la velocità di scansione, la media, l'obiettivo, le dimensioni del foro stenopeico dello zoom e la risoluzione spaziale. Regolare il guadagno in modo che il segnale si trovi nell'intervallo dinamico ottimale e utilizzare gli stessi parametri per tutti i genotipi.
Per visualizzare i motoneuroni all'interno del cordone nervoso ventrale, posizionare il piatto di silicone con il campione sezionato sotto la lente e abbassare la lente in modo che entri in contatto con il trealosio saccarosio HL3. Assicurarsi che l'obiettivo sia completamente immerso nel buffer e aggiungere altro buffer se necessario.
Successivamente, utilizzando i canali CFP e FRET, selezionare manualmente una selezione ottica costituita da almeno 6 motoneuroni a fuoco, situati lungo la linea mediana del cordone nervoso ventrale. Quindi, acquisire immagini ogni 10 secondi o 10 minuti. Queste immagini rappresentano la linea di base.
Per la stimolazione del glucosio, rimuovere il trealosio saccarosio contenente tampone HL3 utilizzando una pipetta Pasteur e aggiungere 5 millimolari di tampone HL3 integrato con glucosio senza muovere il cordone nervoso ventrale. Quindi, acquisire immagini ogni 10 secondi per altri 10 minuti.
Queste immagini rappresentano la fase di stimolazione. Salva le immagini come file dot czi o qualsiasi tipo di file supportato dal software di imaging con un nome file che includa data, background genetico, condizione sperimentale e canali utilizzati. Riutilizzati i parametri per visualizzare tutti i genotipi.