Immunocolorazione di astrociti marcati in fluorescenza in una sezione di tessuto cerebrale di topo

Prendiamo una sezione fissa di tessuto cerebrale di topo contenente una popolazione sparsa di astrociti che esprimono una proteina fluorescente.

Trattare la sezione flottante con un tampone contenente detergente per permeabilizzare le cellule.

Incubare la sezione in un tampone bloccante per prevenire il legame di anticorpi non specifici.

Trattare la sezione con anticorpi primari e incubare per consentire agli anticorpi di legarsi alle proteine fluorescenti negli astrociti.

Lavare via gli anticorpi primari in eccesso utilizzando un tampone.

Successivamente, incubare la sezione con anticorpi secondari marcati con fluoroforo che si legano agli anticorpi primari.

Lavare via gli anticorpi secondari non legati con un tampone.

Trasferire la sezione in una miscela di acqua deionizzata tampone per rimuovere i residui di detersivo.

Posizionare la sezione su un vetrino contenente acqua deionizzata tampone. Rimuovere il liquido in eccesso e aggiungere il supporto di montaggio. Quindi, posizionare un vetrino coprioggetti e fissarlo.

Infine, utilizzare la microscopia confocale per visualizzare gli astrociti fluorescenti marcati che esprimono proteine all'interno della sezione.

Per iniziare, prepara una soluzione fresca di TBST aggiungendo 1 millilitro di Triton X al 10% a una provetta da 50 millilitri e riempiendo la provetta fino a 50 millilitri con TBS. Prepara 2 millilitri di soluzioni bloccanti e anticorpali per ogni cervello combinando siero di capra e TBST in una provetta da 15 millilitri.

Quindi, etichettare una piastra a 24 pozzetti per posizionare campioni diversi in file diverse, in soluzioni diverse, in colonne diverse. Quindi, aggiungere 1 millilitro di TBST alle prime tre colonne etichettate come "Lavaggio 1", "Lavaggio 2" e "Lavaggio 3" e aggiungere 1 millilitro di soluzione bloccante alla quarta colonna.

Prepara un plettro di vetro sciogliendo l'estremità di una pipetta Pasteur da 5,75 pollici in un piccolo gancio usando un bruciatore Bunsen. Quindi trasferire le sezioni di tessuto dalla piastra a 12 pozzetti nella colonna "Wash 1" della piastra a 24 pozzetti utilizzando il pick. Quindi lavare le sezioni per 10 minuti ciascuna nei pozzetti Wash 1, 2 e 3 utilizzando il plettro di vetro per trasferire le sezioni da un pozzetto all'altro, quindi incubare le sezioni per un'ora nella soluzione bloccante.

Successivamente, incubare le sezioni in anticorpi primari per due o tre notti a 4 gradi Celsius agitando. Dopo l'incubazione degli anticorpi primari, aspirare il TBST del primo giorno dai pozzetti di lavaggio. Quindi aggiungere 1 millilitro di nuovo TBST a ogni pozzetto di lavaggio e spostare le sezioni nel primo pozzetto di lavaggio.

Successivamente, incubare le sezioni nell'anticorpo secondario per tre ore a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione secondaria degli anticorpi, aspirare il TBST del secondo giorno dai pozzetti di lavaggio. Quindi aggiungere 1 millilitro di nuovo TBST a ogni pozzetto di lavaggio e spostare le sezioni nel primo pozzetto di lavaggio.

Durante il lavaggio finale, estrarre il supporto di montaggio da 4 gradi Celsius e lasciarlo riscaldare a temperatura ambiente. Quindi preparare una miscela 2 a 1 di TBS in acqua deionizzata e aggiungerla a una capsula di Petri. Successivamente, preparare un vetrino da microscopio aggiungendo sulla superficie 800 microlitri di miscela 2 a 1 di TBS in acqua deionizzata.

Trasferire le sezioni dal pozzetto 'Lavaggio 3' alla piastra di Petri. Quindi, utilizzando un pennello fine, trasferire le sezioni una alla volta dalla capsula di Petri nel liquido sul vetrino. Quindi, disponi con cura le sezioni in modo che siano piatte sul vetrino usando il pennello. Rimuovere con cautela il liquido in eccesso dal vetrino con una pipetta P1000, quindi procedere con l'aspirazione a vuoto.

Una volta rimosso tutto il liquido in eccesso dal vetrino, utilizzare una pipetta di trasferimento per aggiungere immediatamente una goccia di terreno di montaggio a ciascuna sezione e stendere delicatamente un vetrino coprioggetti sul vetrino. Lasciare che il supporto di montaggio si diffonda per alcuni minuti, quindi rimuovere il supporto di montaggio in eccesso che fuoriesce da sotto il vetrino coprioggetti mediante aspirazione a vuoto. Successivamente, sigillare tutti e quattro i bordi del vetrino coprioggetti con smalto trasparente.