Microdissezione a cattura laser per isolare le cellule di Purkinje da un tessuto del cervelletto umano post-mortem

Prendi un tessuto cerebellare umano post-mortem contenente la cellula di Purkinje, il granulo e gli strati cellulari molecolari.

Posizionarlo su un portacampioni del criostato contenente terreni di inclusione parzialmente congelati.

Lasciare che il terreno si congeli completamente, fissando il tessuto.

Trasferire questo gruppo nel braccio di taglio del criostato e lasciare che il tessuto si acclimati alla temperatura del criostato.

Avvicina il tessuto alla lama e taglialo per esporre gli strati della corteccia.

Posizionare una piastra antirollio sopra la lama e ottenere sezioni cerebellari.

Trasferire queste sezioni su un vetrino a membrana.

Incubare in concentrazioni crescenti di etanolo per la fissazione e la disidratazione dei tessuti.

Quindi, incubare in xilene.

Asciugare il vetrino e posizionarlo su un tavolino per microscopio a cattura laser UV.

Posizionare il tappo di raccolta sul tessuto cerebellare.

Microscopicamente, concentrati sulle cellule di Purkinje.

Utilizzando il laser, catturare e raccogliere le cellule di Purkinje per ulteriori analisi.

Per prima cosa, taglia un piccolo pezzo di tessuto per il sezionamento, assicurandoti che la sezione sia composta per circa il 95% da corteccia cerebellare. Rimetti il tessuto rimanente nel ghiaccio secco o in un congelatore a meno 80 gradi Celsius. Quindi, inizia ad aggiungere lentamente l'OCT sopra il mandrino con un lento movimento circolare. Costruire strati di OCT fino a quando non c'è un tumulo, alto circa tre millimetri che copre il mandrino.

Quando l'OCT è parzialmente congelato, ma ha ancora del liquido al centro, posiziona i fazzoletti sopra il tumulo. Lascia riposare i fazzoletti sopra l'OCT per 1 o 2 minuti fino a quando non è completamente congelato. Quindi, trasferire il mandrino con l'OCT congelato e il tessuto nel braccio di taglio del criostato. Regolare il fazzoletto in modo che sia a filo con la lama di taglio e lasciare riposare i fazzoletti nel braccio di taglio per 20 minuti per adattarsi alla nuova temperatura.

La fase più critica consiste nel consentire al tessuto di acclimatarsi nel braccio di taglio del criostato per tutto il tempo necessario. Se il tessuto si frantuma, la visualizzazione cellulare di Purkinje sarà molto difficile. Consiglio di utilizzare pezzi di tessuto più piccoli e sottili per consentire al tessuto di acclimatarsi più velocemente.

Dopodiché, avvicinare lentamente il tessuto alla lama. Una volta che il tessuto ha raggiunto la lama, iniziare il processo di rifinitura. Taglia il tessuto 2 o 3 volte fino a quando gli strati della corteccia sono visibili.

Quindi, posizionare e allineare la piastra antirollio appena sopra la lama del criostato. Tagliare da 4 a 6 sezioni spesse 14 micrometri, notando che le sezioni tagliate correttamente saranno piatte sotto la piastra antirollio. Allineare le sezioni tagliate orizzontalmente lungo il tavolino del criostato.

Inclinare un carrello per prelevare tutti i pezzi di tessuto, contemporaneamente. Subito dopo aver sezionato il tessuto, posizionare il vetrino in un supporto per vetrini con etanolo al 70% su ghiaccio per 2 minuti. Trasferire il vetrino su un supporto per vetrini con etanolo al 95% su ghiaccio per 45 secondi.

Quindi, posizionare il vetrino in un supporto per vetrini con etanolo al 100% a temperatura ambiente per 2 minuti. Immergere il vetrino 3 volte nel supporto per vetrini contenente xilene numero 1 a temperatura ambiente. Quindi, posizionare il vetrino in un supporto per vetrini con xilene 2 a temperatura ambiente per 5 minuti. Posizionare i vetrini in una cappa aspirante pulita e lasciarli asciugare all'aria per almeno 30 minuti.

Innanzitutto, utilizzare la RNasi decontaminata per pulire il tavolino del microscopio nel braccio di raccolta del tappo. Con le mani guantate, posizionare il vetrino sul microscopio e un tappo opaco da 500 microlitri nel braccio di raccolta. A un basso ingrandimento, allineare il cappuccio opaco sul tessuto cerebellare, assicurandosi che il cappuccio copra l'intera area visualizzata nell'oculare.

Usa un obiettivo da 5 a 10 volte per visualizzare gli strati cerebellari. Posiziona il cursore sulla sezione in cui lo strato molecolare e lo strato di cellule granulari si intersecano. Spostati a un ingrandimento di 40 volte e visualizza le celle di Purkinje. Quindi, inizia a catturarli.