Valutazione dello stato di palmitoilazione delle proteine della membrana cellulare dal tessuto cerebrale del topo

Prendi le proteine della membrana cellulare dal tessuto cerebrale del topo.

Queste proteine mostrano modificazioni post-traduzionali con gruppi palmitoil, un acido grasso, attaccato ai residui di cisteina.

Aggiungere un tampone riducente e incubare ad alta temperatura per rompere i legami tra le cisteine non palmitoilate, esponendole.

Incubare con un reagente bloccante che si lega alle cisteine esposte, lasciando reattive solo le cisteine palmitoilate.

Trasferire la soluzione, mescolarla con cloroformio, metanolo e acqua deionizzata, centrifugarla per far precipitare le proteine e rimuovere eventuali impurità. Quindi, aggiungi metanolo, centrifuga e scarta tutti i contaminanti rimanenti.

Aggiungere un tampone, sonicare per solubilizzare il pellet, quindi centrifugare e rimuovere i materiali insolubili.

Applicare un reagente di scissione per rimuovere i gruppi palmitoilici dalle cisteine palmitoilate.

Ripetere la precipitazione cloroformio-metanolo e rimuovere eventuali impurità.

Incubare con un polimero che si lega alle cisteine non bloccate, aiutando a identificare le proteine palmitoilate.

Ripetere la precipitazione cloroformio-metanolo e rimuovere eventuali polimeri non legati.