Valutazione dello stato di palmitoilazione delle proteine della membrana cellulare dal tessuto cerebrale del topo

Prendi le proteine della membrana cellulare dal tessuto cerebrale del topo.

Queste proteine mostrano modificazioni post-traduzionali con gruppi palmitoil, un acido grasso, attaccato ai residui di cisteina.

Aggiungere un tampone riducente e incubare ad alta temperatura per rompere i legami tra le cisteine non palmitoilate, esponendole.

Incubare con un reagente bloccante che si lega alle cisteine esposte, lasciando reattive solo le cisteine palmitoilate.

Trasferire la soluzione, mescolarla con cloroformio, metanolo e acqua deionizzata, centrifugarla per far precipitare le proteine e rimuovere eventuali impurità. Quindi, aggiungi metanolo, centrifuga e scarta tutti i contaminanti rimanenti.

Aggiungere un tampone, sonicare per solubilizzare il pellet, quindi centrifugare e rimuovere i materiali insolubili.

Applicare un reagente di scissione per rimuovere i gruppi palmitoilici dalle cisteine palmitoilate.

Ripetere la precipitazione cloroformio-metanolo e rimuovere eventuali impurità.

Incubare con un polimero che si lega alle cisteine non bloccate, aiutando a identificare le proteine palmitoilate.

Ripetere la precipitazione cloroformio-metanolo e rimuovere eventuali polimeri non legati.

Risospendere il pellet per un'ulteriore analisi dello stato di palmitoilazione delle proteine isolate.

Innanzitutto, interrompere i legami disolfuro incubando la proteina solubilizzata in 25 microlitri di TCEP, per 60 minuti a 55 gradi Celsius. Quindi, bloccare le cisteine libere incubando la soluzione con 12,5 microlitri della soluzione madre di NEM per tre ore a temperatura ambiente.

Successivamente, inizia il processo di precipitazione del cloroformio-metanolo. Trasferire la soluzione proteica dalla provetta da 1,5 millilitri in una provetta di polipropilene o di vetro che può essere centrifugata in un rotore a secchiello oscillante a velocità modesta. Aggiungere 2 millilitri di metanolo e agitare brevemente. Aggiungere 1 millilitro di cloroformio e agitare brevemente. Quindi, aggiungere 1,5 millilitri di acqua deionizzata e agitare di nuovo brevemente.

Se necessario, capovolgere il tubo per garantire una miscelazione accurata. Centrifugare i campioni a 3.000 volte G e 25 gradi Celsius per 30 minuti in un rotore a secchiello oscillante. Rimuovere con cautela e gettare la fase superiore della soluzione in un tubo. Aggiungere 1,5 millilitri di metanolo. Mescolare delicatamente ma accuratamente capovolgendo delicatamente il tubo, facendo attenzione a non frammentare il pancake proteico opaco.

Centrifugare il campione a 3.000 volte G e 25 gradi Celsius per 10 minuti in un rotore a secchiello oscillante. Utilizzando una pipetta sierologica di vetro, rimuovere il più possibile la parte superiore della soluzione senza disturbare il pancake proteico. Sciacquare accuratamente il pellet con 1 millilitro di metanolo e lasciarlo asciugare all'aria per almeno 10 minuti.

Al termine della precipitazione cloroformio-metanolo, iniziare la scissione dei legami palmitoil tioestere riprospendendo il precipitato proteico in 125 microlitri di tampone A. Trasferire in una nuova provetta da 1,5 millilitri. Sonicare brevemente la provetta, quindi centrifugarla a 13.000 volte G o superiore e 25 gradi Celsius per 10 minuti per rimuovere il materiale insolubile.

Trasferire la proteina solubilizzata in nuove provette da 1,5 millilitri e aggiungere 375 microlitri di tampone H o tampone T. Dopo aver incubato i campioni per 60 minuti a temperatura ambiente, ripetere la precipitazione cloroformio-metanolo. Per aggiungere mPEG alle cisteine non protette, iniziare risospendendo il pellet in 100 microlitri di tampone A contenente 10 millimolari di TCEP.

Quindi trasferire la sospensione in un tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere 25 microlitri di soluzione madre mPEG 5k e miscelare mediante pipettaggio. Incubare a temperatura ambiente con rotazione da un'estremità all'altra. Dopo 60 minuti di incubazione, rimuovere l'mPEG 5k non incorporato eseguendo nuovamente la precipitazione del metanolo al cloroformio.

Centrifugare a una temperatura superiore a 13.000 volte G e 25 gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere con cura la fase superiore come prima, evitando la densa frittella flocculante. Aggiungere 1 millilitro di metanolo e mescolare delicatamente ma accuratamente. Centrifugare a una temperatura superiore a 13.000 volte G e 25 gradi Celsius per 10 minuti.

Rimuovere con cura il surnatante e sciacquare il pellet con 1 millilitro di metanolo. Anche in questo caso, centrifugare a una temperatura superiore a 13.000 volte G e 25 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo l'essiccazione all'aria, il pellet viene risospeso in 50 microlitri di tampone A senza TCEP o alcun agente riducente.