Induzione di ictus della sostanza bianca in un modello murino utilizzando un inibitore dell'ossido nitrico

Inizia con un topo anestetizzato immobilizzato in una cornice stereotassica con un cranio esposto.

Segna il bregma, quindi pratica un foro, iniziando posteriormente al bregma e estendendosi anteriormente, appena a sinistra della linea mediana.

Rimuovere gli strati di tessuto per esporre la corteccia cerebrale ricca di assoni mielinizzati e applicare gocce di soluzione salina per prevenire l'essiccazione dei tessuti.

Collegare una pipetta riempita con un inibitore dell'ossido nitrico a un braccio dell'iniettore, posizionato ad angolo per un'iniezione precisa.

Regolare le coordinate stereotassiche e iniettare l'inibitore nella sostanza bianca della corteccia cerebrale, tenendo brevemente la pipetta per evitare il riflusso.

Ritrarre e ripetere l'iniezione ad altre coordinate.

Successivamente, sigillare il foro e chiudere l'incisione con dell'adesivo.

Gli inibitori si legano agli enzimi che producono ossido nitrico nelle cellule endoteliali dei vasi sanguigni, inibendo la produzione di ossido nitrico e restringendo i vasi sanguigni.

Questa costrizione inibisce il flusso sanguigno, portando a danni neuronali e formazione di lesioni, sviluppando un ictus della sostanza bianca.

Inizia, fissando prima una pipetta di vetro tirata su un tubo collegato a una linea del vuoto. Inserire l'estremità estratta nella soluzione di L-Nio o nel tracciante fluorescente L-Nio plus. Avviare l'aspirapolvere e applicare l'aspirazione fino a riempire almeno 2 millimetri della parte di 0,5 millimetri di diametro della pipetta.

Mettere da parte la pipetta piena. Quindi, posizionare il topo in un apparecchio stereotassico dotato di microscopio stereotassico. Dopo aver anestetizzato e preparato il topo per l'intervento chirurgico secondo le procedure approvate, controllare la profondità dell'anestesia con un pizzico di punta. Non ci dovrebbe essere alcuna risposta.

Quindi, regolare il braccio di iniezione a 36 gradi. Fissare un portapipetta di vetro estratto all'estremità distale di un sistema di iniezione a bassa pressione a volume e collegarlo al braccio di iniezione. Dopo aver praticato un'incisione del cuoio capelluto sulla linea mediana di 1,5 centimetri per esporre il cranio, asciugare il cranio superficiale con un batuffolo di cotone.

Quindi, mentre si guarda attraverso un microscopio stereotassico con un ingrandimento da 1 a 3X, utilizzare uno strumento a micro punti per rimuovere il tessuto periostale sovrastante. Segnare la bregma con un pennarello a punta fine, quindi utilizzare un trapano chirurgico dotato di una punta chirurgica a punta fine per praticare una craniotomia ellittica di 2 millimetri, iniziando posteriormente alla bregma e estendendosi anteriormente appena a sinistra della linea mediana.

Rimuovere i frammenti ossei e i tessuti molli sovrastanti in modo che la corteccia cerebrale possa essere visualizzata. Mantenere umida la superficie corticale applicando a intermittenza gocce di soluzione fisiologica sterile. Quindi, fissare la pipetta piena al braccio dell'iniettore. Allineare l'estremità distale della pipetta con bregma e azzerare le coordinate stereotassiche.

Far avanzare la pipetta fino al primo punto di iniezione utilizzando le coordinate anteriori, posteriori e laterali mediali elencate nella tabella 1. Quindi, far avanzare la pipetta sulla superficie corticale e azzerare la misurazione ventrale dorsale. Abbassare lentamente la pipetta fino alla coordinata ventrale dorsale.

Assicurarsi che l'ingrandimento del microscopio stereotassico sia impostato su 3X e che il reticolo calibrato possa essere visualizzato chiaramente. Osservare la pipetta angolata lateralmente in modo che il menisco del fluido atmosferico abbia una vista sagittale. Il menisco deve apparire sullo stesso piano focale sia della parete interna che di quella esterna della pipetta.

Ora, utilizzando un sistema di iniezione a bassa pressione di volume, impostato a 20 PSI per impulsi di 20 millisecondi, iniettare 100 nanolitri di L-Nio nel cervello. Dopo aver iniettato il volume totale, attendere 5 minuti per evitare il reflusso lungo il binario della pipetta. Quindi, prelevare la pipetta e ripetere la procedura di iniezione alla seconda e terza serie di coordinate fornite nella tabella 1.

Dopo l'iniezione finale, rimuovere la pipetta e posizionare una quantità sufficiente di cera ossea per riempire il sito della craniotomia. Infine, approssimare i bordi della ferita del cuoio capelluto e legare con adesivo dermico.