JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
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Prendiamo la parete corporea delle larve di Drosophila, costituita da muscoli innervati dai motoneuroni per formare giunzioni neuromuscolari o NMJ.
La membrana muscolare postsinaptica presso l'NMJ contiene proteine interagenti legate alla membrana, che sono marcate con anticorpi primari.
Aggiungere sonde per il saggio di legatura di prossimità, o PLA, contenenti anticorpi secondari coniugati a oligonucleotidi a filamento singolo. Incubare per far sì che le sonde si leghino agli anticorpi primari.
Lavare via tutte le sonde non legate.
Incubare con tampone di legatura contenente oligonucleotidi connettore ed enzimi ligasi.
La vicinanza delle proteine interagenti facilita il legame del connettore alle sonde. La ligasi quindi sigilla le lacune, creando DNA circolare.
Lavare via tutti i connettori non legati.
Incubare con una soluzione di amplificazione contenente polimerasi, che amplifica il DNA circolare attraverso l'amplificazione a cerchio rotante.
Le sonde del rivelatore marcate con fluoroforo nella soluzione si riuniscono al DNA amplificato e, dopo l'eccitazione, producono un segnale fluorescente.
Montare la parete corporea su un vetrino per visualizzare le interazioni proteina-proteina marcate in fluorescenza presso l'NMJ.
Per iniziare il test, aggiungere una diluizione da 1 a 5 in almeno 200 microlitri di volume totale sia della sonda PLA anti-topo meno che della sonda PLA anti-coniglio più in 1% di BSA alle pareti del corpo. Incubare per due ore a 37 gradi Celsius.
Dopo aver utilizzato il tampone di lavaggio A per lavare le pareti del corpo due volte per 5 minuti ciascuna, aggiungere una diluizione da 1 a 40 di ligasi in soluzione di ligasi. Incubare per un'ora a 37 gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, utilizzare il tampone di lavaggio A per lavare le pareti del corpo due volte per 2 minuti ciascuna prima di aggiungere una diluizione da 1 a 80 di polimerasi in soluzione di amplificazione. Incubare per due ore a 37 gradi Celsius.
Per preparare i campioni per l'imaging, utilizzare il tampone di lavaggio B per lavare le pareti del corpo due volte per 10 minuti ciascuna. Quindi utilizzare una diluizione 100 X del tampone di lavaggio B per eseguire un lavaggio finale per 1 minuto. Equilibrare le pareti del corpo in poche gocce di soluzione di montaggio per almeno 30 minuti.
Utilizzando una pinza fine, trasferire con cura le pareti del corpo su uno scivolo a piattaforma con le cuticole rivolte verso il basso. Posizionarli in file con lo stesso orientamento entro una o due gocce dalla soluzione di montaggio. Posizionare un vetrino coprioggetti di 22 millimetri per 40 millimetri sul preparato, facendo attenzione a non generare bolle d'aria. Quindi, usa lo smalto trasparente per sigillare il vetrino.