Determinazione della capacità di ritenzione del calcio dei mitocondri isolati

Posizionare i mitocondri isolati dalle cellule di neuroblastoma in un tampone contenente un colorante fluorescente impermeabile alla membrana e legante il calcio.

Incubare per consentire ai mitocondri di stabilizzarsi nel tampone.

Aggiungere un tampone contenente calcio e incubare agitando.

Gli ioni calcio si legano alle molecole del colorante, provocandone la fluorescenza.

Utilizzando uno spettrometro a fluorescenza, monitora la fluorescenza del colorante in tempo reale.

Ora, iniettare il tampone contenente calcio a intervalli regolari.

L'aumento della concentrazione di calcio favorisce l'assorbimento mitocondriale del calcio, riducendo gli ioni di calcio liberi disponibili per legarsi al colorante, con conseguente diminuzione della fluorescenza.

Una volta che i mitocondri raggiungono la loro massima capacità di immagazzinamento del calcio, un'ulteriore aggiunta di calcio innesca l'apertura del poro di transizione della permeabilità mitocondriale (mPTP).

Questa apertura dei pori rilascia il calcio dai mitocondri nel tampone, dove si lega al colorante e provoca un aumento della fluorescenza.

Determinare la quantità totale di calcio necessaria per indurre l'apertura dell'mPTP, che riflette la capacità di ritenzione del calcio mitocondriale.

Preparare il terreno di cloruro di potassio e aggiungere il colorante fluorescente verde legante il calcio a una concentrazione finale di 0,5 micromolari prima dell'esperimento. Per determinare la capacità di ritenzione del calcio mitocondriale, trasferire prima 1 millilitro di mitocondri isolati in terreni di cloruro di potassio contenenti 0,5 micromolari di colorante fluorescente verde legante il calcio in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.

Incubare i mitocondri nel colorante fluorescente verde legante il calcio nella piastra a 6 pozzetti a temperatura ambiente. Proteggerlo dalla luce ambientale per 1 minuto. Dopo l'incubazione, aggiungere aliquote da 4 microlitri di una soluzione di cloruro di calcio da 20 millimolari a ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti, utilizzando l'impostazione di erogazione automatica per introdurre 200 nanomoli di calcio per milligrammo di proteina mitocondriale.

Utilizzare uno spettrometro fluorescente per monitorare le variazioni di fluorescenza ogni tre secondi per 2 minuti, con una lunghezza d'onda di eccitazione di 506 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 531 nanometri. La piastra è dotata di agitazione a 600 RPM per 3 secondi tra una lettura e l'altra, controllata da software. Aggiungere un'ulteriore aliquota di 4 microlitri di soluzione di cloruro di calcio da 20 millimolari a ciascun pozzetto, quindi monitorare le variazioni di fluorescenza ogni 3 secondi per 2 minuti.