Immunoistochimica di sezioni di tessuto cerebrale di topo per il targeting dei neuroni della dopamina

Prendi un vetrino rivestito di polimero con sezioni di tessuto cerebrale di topo contenenti neuroni dopaminergici che esprimono tirosina idrossilasi, un enzima chiave per la sintesi della dopamina.
Delinea le sezioni con una penna idrofobica per garantire una colorazione uniforme.
Fissa il tessuto in una soluzione di acetone-metanolo per preservare la morfologia del tessuto.
Risciacqua con un tampone contenente detersivo per permeabilizzare le membrane cellulari.
Incubare con anticorpi primari che hanno come bersaglio la tirosina idrossilasi nei neuroni dopaminergici, quindi lavare per rimuovere gli anticorpi non legati.
Aggiungere anticorpi secondari marcati con colorante fluorescente, colorante nucleare e inibitori della RNasi.
Durante l'incubazione, gli anticorpi secondari si legano agli anticorpi primari, i coloranti nucleari marcano il nucleo e gli inibitori della RNasi inattivano le RNasi.
Risciacquare con tampone. Quindi, disidratare le sezioni di tessuto in concentrazioni crescenti di etanolo.
Incubare in xilene per liberare il tessuto.
Le sezioni di tessuto processate sono ora pronte per la microdissezione a cattura laser, che consente una visualizzazione e una dissezione precise dei neuroni dopaminergici bersaglio.

Per eseguire l'immunoistochimica, usa una penna idrofobica per delineare i tessuti e lasciarli asciugare. Quindi, in una soluzione di acetone metanolo 1 a 1, fissare il tessuto a 20 gradi Celsius negativi per 10 minuti. Dopo aver tolto il fazzoletto dal congelatore, coprire le sezioni con 100-200 microlitri di anticorpo tirosina idrossilasi in PBS e tritone all'1% per 10 minuti.

Quindi, usa PBS con tritone all'1% per risciacquare le diapositive prima di coprire le sezioni con 100-200 microlitri di IgG anticoniglio di capra, etichettato con Alexa Fluor 488. Incubare per cinque minuti, quindi utilizzare il PBS per sciacquare i vetrini due volte. Successivamente, disidratare i campioni in una serie graduata di etanolo libero da RNasi per 30 secondi ciascuno, come dimostrato in precedenza in questo video. Incubare in xilene, per un minuto e un secondo lavaggio, per cinque minuti. Rimuovere le diapositive immediatamente prima dell'uso per LCM e lasciarle asciugare all'aria.