JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 5:13 min • April 28th, 2025
Prendi una mosca adattata al buio, anestetizzata, transgenica, con gli occhi bianchi.
La mosca esprime canali ionici TRPL marcati con eGFP nei fotorecettori dell'occhio.
Nell'oscurità, TRPL localizza sulle membrane dei rabdomeri, i microvilli dei fotorecettori.
Usando l'aria compressa, spingi la mosca a testa in giù in un puntale di pipetta.
Taglia la punta e spingi la mosca all'indietro.
Taglialo di nuovo e spingi la mosca in avanti fino a quando sporge solo la sua testa.
Immobilizza la punta nell'argilla da modellare attaccata a un vetrino e posizionala su un tavolino per microscopio a fluorescenza, con l'occhio rivolto radialmente verso l'obiettivo del microscopio.
Aggiungi una goccia d'acqua all'obiettivo, poi abbassalo fino a toccare l'occhio.
Cattura immagini dei fotorecettori.
Misura le intensità di fluorescenza nei rabdomeri, nel corpo cellulare e sullo sfondo.
Illumina la mosca con luce arancione per indurre la traslocazione TRPL nel corpo cellulare.
Ripeti le misurazioni di imaging e fluorescenza.
Confronta le immagini per osservare la ridotta fluorescenza rabdomerale post-illuminazione, indicando la traslocazione TRPL nel corpo cellulare.
Per preparare una mosca in una variante non letale, trasferire la mosca anestetizzata con ghiaccio a testa in giù in una punta per pipetta da 200 microlitri e spingere con cautela la mosca verso la punta con aria compressa. Quindi, usando un bisturi, tagliare la punta della pipetta proprio davanti alla testa. E usando una pinzetta, spingi con cautela la mosca di alcuni millimetri nel puntale della pipetta.
Tagliare nuovamente il puntale della pipetta. E spingere la mosca indietro verso il puntale con l'aria compressa, in modo che solo la testa della mosca sporga dal puntale della pipetta. Dopo aver fatto aderire un pezzo di plastilina su un vetrino, premere la punta della pipetta in modo che l'occhio sinistro o destro sia rivolto verso l'alto. Assicurarsi che l'occhio sia orientato correttamente al microscopio. Per l'acquisizione delle immagini, selezionare un obiettivo a immersione in acqua.
Nel caso di una variazione non letale, utilizzare una pipetta da laboratorio per far aderire una grossa goccia di acqua refrigerata sul lato inferiore dell'obiettivo di immersione in acqua. Posizionare con cautela il vetrino dell'oggetto con la mosca preparata sul tavolino del microscopio. Quindi, abbassare manualmente l'obiettivo di immersione in acqua fino a quando non tocca la superficie dell'acqua o l'occhio della mosca tocca la goccia.
Quindi, spostare il percorso della luce verso la fotocamera del microscopio e generare un'immagine dal vivo. Regolare nuovamente la messa a fuoco della fotocamera e valutare l'orientamento dell'occhio, considerando che l'occhio deve essere rivolto radialmente verso l'obiettivo del microscopio. Utilizzare il software della tabella di ricerca per rilevare la sovrasaturazione.
Nel caso di mosche non pigmentate, regolare il tempo di esposizione in modo che i pixel più luminosi siano appena al di sotto del limite di saturazione per ogni immagine. Registra un'immagine e salvala come file raw per archiviare tutti i metadati corrispondenti della registrazione. Quindi, esporta l'immagine in formato TIFF a punti.
Per quantificare la fluorescenza relativa dell'EGFP nei rabdomeri delle micrografie a immersione in acqua, regolare le impostazioni di ImageJ facendo clic su Analizza. Quindi, impostare le misure e selezionare solo la casella per il valore medio del grigio. Importa l'immagine TIFF a punti facendo clic su File, quindi su Apri. Scegli una regione rappresentativa dell'immagine a fuoco e ingrandiscila dal 200% al 300% premendo ripetutamente Ctrl e Più insieme.
Quindi, seleziona lo strumento Ovale. E mentre si preme il tasto Maiusc, genera una selezione circolare nell'immagine che è significativamente più piccola di un rabdomero fluorescente. Quindi, cerca le dimensioni esatte visualizzate sotto la barra degli strumenti nella finestra principale di ImageJ. Per misurare le intensità di fluorescenza all'interno della selezione circolare, sposta il cerchio sul primo rabdomero con i tasti freccia sulla tastiera e fai clic su Analizza, quindi misura.
Apparirà una finestra dei risultati che elenca il valore di grigio misurato. Continuare con le misurazioni dei rabdomeri da 2 a 6 e misurare anche il segnale di fondo. Nel caso di mosche non pigmentate, effettuare ulteriori misurazioni delle aree del corpo cellulare corrispondenti. Misurare la fluorescenza di altri due ommatidi, ottenendo tre repliche tecniche. Contrassegnare gli ommatidi analizzati utilizzando lo strumento matita e salvare questa immagine per la documentazione.
Seleziona e copia i valori di grigio misurati dalla finestra dei risultati e incollali nel software per fogli di calcolo per ulteriori calcoli. Ordina i valori dell'intensità della fluorescenza in base alla loro origine nel rabdome, nel corpo cellulare e nello sfondo della categoria e calcola l'intensità media di ciascuna categoria. Quindi calcola la quantità relativa di EGFP presente nel rabdomero, utilizzando la prima formula per gli occhi non pigmentati e la seconda per gli occhi pigmentati.