Rilevamento delle modificazioni istoniche nelle cellule di lievito con sovraespressione di proteine neurodegenerative

Inizia con una sospensione di cellule di lievito che sovraesprimono proteine legate a malattie neurodegenerative.

Questa proteina sovraespressa è responsabile delle modifiche nelle proteine che impacchettano il DNA o negli istoni con frazioni chimiche.

Aggiungi idrossido di sodio e beta-mercaptoetanolo e poi incuba su ghiaccio.

L'idrossido di sodio e il beta-mercaptoetanolo lisano le cellule, rilasciando le proteine intracellulari, compresi gli istoni.

Centrifuga il lisato per raccogliere le proteine. Scartare il surnatante.

Aggiungi un colorante di caricamento al pellet proteico e riscaldalo per denaturarli.

Carica queste proteine denaturate e un marcatore proteico sul gel e sull'elettroforese per separarle in base alle dimensioni.

Elettrotrasferisci le proteine su una membrana, lava e aggiungi un tampone bloccante per evitare legami non specifici.

Aggiungi anticorpi primari che si legano specificamente agli istoni modificati.

Lavare per rimuovere gli anticorpi non legati e incubare con anticorpi secondari fluorescenti, che si legano agli anticorpi primari.

Una banda fluorescente distinta conferma le modifiche istoniche, indicando la sovraespressione di proteine neurodegenerative.

Per lisa