Rilevamento delle modificazioni istoniche nelle cellule di lievito con sovraespressione di proteine neurodegenerative

Inizia con una sospensione di cellule di lievito che sovraesprimono proteine legate a malattie neurodegenerative.

Questa proteina sovraespressa è responsabile delle modifiche nelle proteine che impacchettano il DNA o negli istoni con frazioni chimiche.

Aggiungi idrossido di sodio e beta-mercaptoetanolo e poi incuba su ghiaccio.

L'idrossido di sodio e il beta-mercaptoetanolo lisano le cellule, rilasciando le proteine intracellulari, compresi gli istoni.

Centrifuga il lisato per raccogliere le proteine. Scartare il surnatante.

Aggiungi un colorante di caricamento al pellet proteico e riscaldalo per denaturarli.

Carica queste proteine denaturate e un marcatore proteico sul gel e sull'elettroforese per separarle in base alle dimensioni.

Elettrotrasferisci le proteine su una membrana, lava e aggiungi un tampone bloccante per evitare legami non specifici.

Aggiungi anticorpi primari che si legano specificamente agli istoni modificati.

Lavare per rimuovere gli anticorpi non legati e incubare con anticorpi secondari fluorescenti, che si legano agli anticorpi primari.

Una banda fluorescente distinta conferma le modifiche istoniche, indicando la sovraespressione di proteine neurodegenerative.

Per lisare le cellule per l'analisi western blot, scongelare i pellet di cellule di lievito su ghiaccio prima della risospensione in 100 microlitri di acqua distillata. Aggiungere 300 microlitri di idrossido di sodio 0,2 molare e 20 microlitri di 2-mercaptoetanolo a ciascun campione di cellule. E risospendere i pellet mediante pipettaggio.

Dopo un'incubazione di 10 minuti su ghiaccio, pellettare le cellule mediante centrifugazione e risospendere i campioni in 100 microlitri di colorante di caricamento. Quindi far bollire i campioni per 10 minuti su un blocco riscaldante. Durante la lisatura dei campioni, posizionare due gel in un supporto per gel e riempire la camera interna fino all'alto con il tampone di scorrimento e la camera esterna fino al segno di linea a due gel.

Quando i campioni sono pronti, caricare 15 microlitri di ciascuna soluzione di lisi cellulare in ciascun pozzetto del gel di poliacrilammide al 12% a 10 pozzetti e aggiungere 5 microlitri di scala proteica al pozzetto della corsia della scala proteica. Far funzionare il gel per circa 45 minuti a 150 volt o fino a quando la parte anteriore di caricamento del colorante raggiunge il fondo del gel.

Mentre il gel è in funzione, immergere due cuscinetti di fibre per gel nel tampone di trasferimento e una membrana di fluoruro di polivinilidene o PVDF per gel nel metanolo. Quando il gel è pronto, sciacquare la membrana e il tampone di trasferimento. E posizionare un tampone in fibra pre-imbevuto sul fondo di una cella dell'apparato di trasferimento semi-asciutta, seguito dalla membrana PVDF, dal gel e dal secondo tampone in fibra pre-imbevuta.

Quindi impostare la potenza a 150 milliampere per 1 ora. Al termine del trasferimento delle proteine, rimuovere la membrana dall'apparato di trasferimento per un breve risciacquo con acqua distillata. Posizionare la proteina di membrana risciacquata con il lato rivolto verso l'alto in una piccola scatola di colorazione e coprire la membrana con soluzione salina tamponata Tris o tampone bloccante TBS per un'incubazione di 1 ora a temperatura ambiente con un leggero dondolio.

Al termine dell'incubazione bloccante, incubare la membrana per una notte con un istone anti-lievito e un anticorpo specifico per la modifica in TBS a 4 gradi Celsius e un anticorpo di controllo del carico nucleare appropriato.

La mattina successiva, lavare la membrana quattro volte in TBS, integrata con polisorbato 20 allo 0,1% per cinque minuti con oscillazione a temperatura ambiente per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare il blot con gli anticorpi secondari appropriati per 1 ora a temperatura ambiente, seguito da quattro lavaggi di 5 minuti in TBST e un lavaggio di cinque minuti in TBS da solo con oscillazione.

Quindi visualizzare il blot su un sistema di imaging western blot fluorescente per 2 minuti.