Rilevamento della proteina associata alla malattia neurodegenerativa α-sinucleina mediante ELISA

Iniziamo con il tessuto cerebrale di un topo transgenico che sovraesprime la α-sinucleina mutata, una proteina neuronale mal ripiegata associata a malattie neurodegenerative, immersa in un tampone ad alto contenuto di sale.

Omogeneizzare il tessuto con un pestello grande, seguito da un piccolo pestello per distruggere il tessuto e rilasciare proteine intracellulari, tra cui la α-sinucleina.

Trasferire l'omogeneizzato in una provetta e centrifugare. Raccogliere il surnatante contenente proteine e diluirlo con un tampone.

Aggiungere questo surnatante a una micropiastra rivestita di anticorpi specifici per la α-sinucleina pretrattata con un agente bloccante per prevenire il legame aspecifico.

Incubare con agitazione, permettendo alla α-sinucleina normale e mutata di legarsi.

Lavare la piastra, quindi aggiungere anticorpi di rilevamento specifici per la α-sinucleina mutata e incubare agitando.

Lavare nuovamente e aggiungere anticorpi legati agli enzimi, quindi incubare sotto agitazione.

Aggiungere il substrato e incubare al buio sotto agitazione. Il substrato reagisce con l'enzima per produrre un cambiamento di colore.

Arrestare la reazione con un acido e misurare l'assorbanza per quantificare