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Iniziamo con il tessuto cerebrale di un topo transgenico che sovraesprime la α-sinucleina mutata, una proteina neuronale mal ripiegata associata a malattie neurodegenerative, immersa in un tampone ad alto contenuto di sale.
Omogeneizzare il tessuto con un pestello grande, seguito da un piccolo pestello per distruggere il tessuto e rilasciare proteine intracellulari, tra cui la α-sinucleina.
Trasferire l'omogeneizzato in una provetta e centrifugare. Raccogliere il surnatante contenente proteine e diluirlo con un tampone.
Aggiungere questo surnatante a una micropiastra rivestita di anticorpi specifici per la α-sinucleina pretrattata con un agente bloccante per prevenire il legame aspecifico.
Incubare con agitazione, permettendo alla α-sinucleina normale e mutata di legarsi.
Lavare la piastra, quindi aggiungere anticorpi di rilevamento specifici per la α-sinucleina mutata e incubare agitando.
Lavare nuovamente e aggiungere anticorpi legati agli enzimi, quindi incubare sotto agitazione.
Aggiungere il substrato e incubare al buio sotto agitazione. Il substrato reagisce con l'enzima per produrre un cambiamento di colore.
Arrestare la reazione con un acido e misurare l'assorbanza per quantificare la α-sinucleina mutata.
Per preparare gli omogeneizzati cerebrali, aggiungere un volume adeguato di tampone HS alle regioni cerebrali sezionate per raggiungere una percentuale di omogeneizzato prevista, come mostrato nella tabella seguente. Utilizzando un macinatore di tessuti composto da un tubo di vetro borosilicato e due pestelli, A e B, versare una regione cerebrale da frantumare nel tubo. E poi con il pestello A, omogeneizzare il tessuto 10 volte per dissociarlo.
Quindi, passa al pestello B e omogeneizza altre 20 volte. Con una pipetta di trasferimento, trasferire l'omogenato in una provetta da 1,5 millilitri, ripetendo l'omogeneizzazione con i campioni cerebrali rimanenti. Centrifugare i campioni a 1.000 g per cinque minuti, a quattro gradi Celsius. E poi raccogli i surnatanti e dividili in aliquote da 200 microlitri.
Con 100 microlitri della soluzione di rivestimento dell'anticorpo, rivestire i pozzetti di micropiastre da 96 pozzetti e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, aggiungere 300 microlitri di PBST ai pozzetti e utilizzare una lavatrice per piastre per lavare le piastre cinque volte. Mentre si lavora a temperatura ambiente, andando avanti, aggiungere 200 microlitri di tampone bloccante T20 PBS a ciascun pozzetto e agitare le piastre a 150 giri/min per un'ora prima di utilizzare PBST per lavare le piastre cinque volte.
Utilizzando PBST, l'1% di BSA, diluire gli omogeneizzati cerebrali utilizzando le linee guida elencate qui. E aggiungi 100 microlitri a ciascun pozzetto. Quindi incubare a temperatura ambiente e 150 giri/min per due ore prima di utilizzare PBST per lavare le piastre cinque volte.
Dopo il lavaggio finale, aggiungere gli anticorpi necessari per la rilevazione dell'alfa sinucleina diluiti in PBST e BSA all'1% come elencato nella tabella due del protocollo di testo. Incubare a temperatura ambiente e 150 giri/min per un'ora prima di lavare le piastre cinque volte come prima.
Successivamente, aggiungere coniugati HRP IGG anti-topo o anti-coniglio diluiti da 1 a 8.000 in PBST, 1% BSA. E incubare a 150 giri/min per un'ora prima di lavare le piastre cinque volte. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione di TMB a ciascun pozzetto e incubare a 150 giri/min per 15 minuti al buio. Arrestare la reazione aggiungendo 100 microlitri di un normale acido cloridrico per pozzetto. Quindi, utilizzare un lettore di micropiastre per misurare l'assorbanza a 450 nanometri.