Analisi LC-MS/MS del profilo proteomico di granuli di neuromelanina isolati da tessuto cerebrale umano

Inizia con peptidi derivati da granuli di neuromelanina (NMG) isolati da tessuto cerebrale umano post mortem.

NMG, che si trovano nei neuroni che producono dopamina, contengono pigmenti di neuromelanina, proteine e lipidi.

Prendi una colonna di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) contenente una fase stazionaria a base di silice funzionalizzata con ligandi idrofobici.

Carica i peptidi sulla colonna.

I peptidi idrofobici si legano più fortemente alla colonna rispetto a quelli idrofili.

Passa un buffer di eluizione attraverso la colonna.

I peptidi meno idrofobici eluiscono per primi, mentre quelli più idrofobici eluiscono dopo.

I peptidi eluiti entrano nella sorgente di ionizzazione elettrospray dello spettrometro di massa, dove vengono ionizzati in ioni peptidi carichi.

I peptidi ionizzati entrano quindi nell'analizzatore di massa, dove vengono separati in base al loro rapporto massa-carica.

Uno ione peptidico selezionato viene diretto verso la cella di collisione e frammentato in ioni più piccoli, i cui rapporti massa-carica vengono misurati di nuovo.

Infine, i dati vengono confrontati con un database di riferimento per identificare le proteine presenti nel campione NMG.

Dopo aver eseguito la digestione triptica, come descritto nel testo, preparare il campione per l'analisi HPLC-MS sciogliendo da 200 a 400 nanogrammi di peptidi campione in un volume definito dello 0,1% TFA in ingressi di fiale di vetro per spettrometria di massa inerte. Se la determinazione della concentrazione non è applicabile a causa di una bassa quantità di campione, verificare lo stesso carico di campione confrontando la corrente ionica totale.

Per iniziare l'analisi proteomica dei dati grezzi, fai clic su Carica per caricare i file grezzi nel software. Fare clic su Imposta esperimento per assegnare i nomi dei campioni. Per definire i parametri specifici del gruppo, aggiungere le modifiche scegliendo Deamidation NQ, Oxidation M e Carbaminomethylation N-Term come modifiche variabili. E poi aggiungere la carbamminometilazione C come modifica fissa. Scegli la tripsina come enzima di digestione nella scheda di digestione.

Nella scheda di quantificazione senza etichette. Aggiungi l'opzione, LFQ. E se devono essere elaborati più di 10 file, scegli l'opzione LFQ veloce per ridurre i tempi di elaborazione. Assicurandosi che tutti gli altri parametri specifici del gruppo rimangano nelle impostazioni di fabbrica, passare alla scheda Parametri globali e aggiungere il file FASTA derivato da uniprot.org nella scheda Sequenze. Modificare la regola di identificazione di conseguenza e aggiungere l'ID tassonomia 9606 per Homo sapiens.

Per la quantificazione delle proteine, scegli peptidi unici e rasoio. Quindi, aggiungi l'opzione iBAQ come misura per la quantificazione delle proteine nella scheda Quantificazione senza etichetta. Assicurarsi che tutti gli altri parametri globali rimangano nelle impostazioni di fabbrica e fare clic su Avvia. Dopo che l'analisi è stata eseguita con successo, recuperare l'output .txt del gruppo proteico.