JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:01 min. • April 28th, 2025
Inizia con una piastra multipozzetto a fondo piatto rivestita con una matrice di membrana basale, che contiene polimero extracellulare e proteine di adesione che imitano la matrice del microambiente tumorale.
Introduci un terreno contenente una neurosfera di cellule di glioma derivate da un tumore cerebrale pediatrico, assicurandoti che sia posizionato centralmente nel pozzetto.
La matrice promuove l'attaccamento della neurosfera al pozzo.
Aggiungi un reagente soppressore di sfondo per ridurre al minimo la fluorescenza non specifica.
Successivamente, introduci gli anticorpi anti-CD44 coniugati con fluoroforo verde.
Trasferisci la lastra a un sistema di imaging di cellule vive alloggiato all'interno di un incubatore che mantiene le condizioni fisiologiche della cellula.
Nel corso del tempo, le cellule di glioma esprimono la proteina di adesione cellulare CD44, che interagisce con le proteine di adesione.
Questo attiva la via di segnalazione cellulare e facilita la migrazione cellulare dalla neurosfera.
Gli anticorpi anti-CD44 coniugati con fluoroforo si legano al CD44 espresso sulle cellule di glioma, rendendole fluorescenti.
L'aspetto di cellule fluorescenti verdi che si allontanano dalla neurosfera conferma la migrazione delle cellule di glioma.
Una volta che i pozzetti sono rivestiti di BMM, taglia una punta P200. Prelevare 50 microlitri di terreno cellulare e NS da ciascun pozzetto selezionato e trasferirlo in un pozzetto rivestito e piatto sul fondo. Verificare visivamente la presenza e la posizione del NS in ogni pozzo. Aggiungere delicatamente 50 microlitri di anticorpi BSR e ALR diluiti in ciascun pozzetto, aspettando due o tre minuti per consentire ai reagenti di mescolarsi. E utilizzando un microscopio invertito, assicurarsi che la maggior parte delle NS replicate siano posizionate centralmente nel pozzetto. Dopo essersi assicurati dell'assenza di bolle, trasferire delicatamente la piastra nello strumento di analisi delle cellule vive come dimostrato in precedenza.
Sul software dello strumento di analisi delle cellule vive, seleziona l'opzione Programma per l'acquisizione. Quindi, fai clic sulla scheda più e seleziona Scansione su pianificazione per scansionare le lastre con intervalli come indicato nel manoscritto del testo. Nella finestra del software, creare o ripristinare l'imbarcazione, quindi fare clic sull'opzione Nuovo. Selezionare il tipo di scansione di clonazione della diluizione, l'obiettivo 4X e la fase e il verde per il test di migrazione. Selezionare il tipo di piastra e definire i pozzetti da scansionare evidenziandoli sulla mappa della piastra. Quindi, imposta la frequenza di scansione. Fare clic su Aggiungi alla pianificazione e avviare la scansione.