Rilevamento del cotrasportatore neuronale potassio-cloruro 2 fosforilato tramite Western Blotting

Prendi un lisato cellulare contenente il cotrasportatore 2 di cloruro di potassio, o le proteine KCC2, che regolano i livelli di cloruro neuronale.

La fosforilazione nei siti regolatori interrompe la funzione di KCC2, modulando l'attività neuronale.

Aggiungi il lisato alle perle coniugate con anticorpi che hanno come bersaglio KCC2 fosforilato. Incubare per consentire il legame, quindi lavare per rimuovere le proteine non legate e i detriti cellulari.

Trattare con un tampone denaturante ad alta temperatura per rilasciare KCC2, quindi centrifugare per separare le perle.

Carica il surnatante contenente KCC2 su un gel per elettroforesi. Separare le proteine in bande per confermare la presenza di KCC2 fosforilata.

Trasferisci le bande su una membrana, poi incubale in una soluzione bloccante per mascherare siti di legame non specifici.

Incubare con anticorpi primari che hanno come bersaglio KCC2 fosforilato.

Lava, poi incuba con anticorpi secondari marcati con enzimi per etichettare gli anticorpi primari.

Lava di nuovo, poi aggiungi un substrato chemiluminescente, che reagisce con l'enzima per produrre luce.

Misura l'intensità della luce per quantificare il KCC2 fosforilato nel lisato.

Pipetta 300 microlitri di proteina G sefarosio in una provetta per microcentrifuga. Quindi, centrifugare la soluzione a 500 G per due minuti. Dopo aver scartato il surnatante, aggiungere 500 microlitri di PBS e agitare bene. Scartare il surnatante dopo la centrifugazione e ripetere questo passaggio.

Quindi, mescola 1 milligrammo di anticorpi anti-KCC2 treonina 906 e anti-KCC2 treonina 1007 con 200 microlitri di perle di proteina G separosio, prima di aumentare il volume a 500 microlitri con PBS. Dopo aver agitato su una piattaforma vibrante o una ruota rotante per due ore a 4 gradi Celsius, ripetere due lavaggi con PBS.

Esegui la quantificazione delle proteine sui lisati cellulari e aggiungi 1 milligrammo del lisato cellulare alle perle lavate e incuba in un rotatore end-to-end prima di filare. Somministrare tre lavaggi con PBS contenente 150 millimolari di cloruro di sodio, seguiti da tre lavaggi con 200 microlitri di PBS prima di risospendere il pellet finale in 100 microlitri di tampone per campioni LDS.

Agita le provette in un agitatore a rotore a temperatura ambiente per cinque minuti. Incubarli in un blocco riscaldante e centrifugarli prima di utilizzare il surnatante per il caricamento del gel. Assemblare l'apparato di colata western blot e versare il gel separatore all'8% appena preparato per colare il gel, lasciando circa 2 centimetri di spazio dalla parte superiore del vetro colato. Aggiungere 200 microlitri di isopropanolo assoluto alla configurazione e lasciarlo riposare a temperatura ambiente per 60 minuti.

Rimuovi l'isopropanolo usando una pipetta, e risciacqua accuratamente il gel con circa 200 microlitri di acqua distillata. Dopo aver aggiunto il gel di impilamento al 6% appena preparato alla configurazione di colata, inserire delicatamente il pettine a fontana e lasciare riposare a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi, fissare il gel colato nel serbatoio dell'elettroforesi.

Dopo aver versato il tampone in esecuzione nel serbatoio, carica 5 microlitri di marcatore di peso molecolare nel primo pozzetto e una quantità uguale di proteine in ogni pozzetto del gel SDS-PAGE. Riempi i pozzetti vuoti con LDS e fai scorrere il gel per circa 90-120 minuti a 120 volt. Reidratare la membrana di nitrocellulosa con tampone di trasferimento contenente il 20% di metanolo.

Risciacqua il gel e la membrana con il tampone di trasferimento e distribuiscili delicatamente sulla pila di preparazione. Disporre il sandwich da trasferire in questo ordine, elettrodo negativo, schiuma sandwich, carta da filtro, gel SDS-PAGE risciacquato, membrana nitrocellulosica risciacquata, carta da filtro, schiuma sandwich, elettrodo positivo. Una volta terminato, impilare il sandwich assemblato nel serbatoio di trasferimento e farlo funzionare a 90 volt per 90 minuti o 30 volt per 360 minuti.

Blocca la membrana asciutta per 1 ora a temperatura ambiente utilizzando un tampone bloccante. Incubare le membrane con opportune diluizioni dell'anticorpo primario e della beta actina in tampone bloccante per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 gradi Celsius. Quindi, somministrare tre lavaggi di TBST per 5 minuti ciascuno.

Incubare la membrana lavata con un anticorpo secondario diluito in un tampone bloccante per 60 minuti, e ripetere tre lavaggi di TBST. Una volta fatto, posizionare la membrana lavata sulla scheda di imaging. Per sviluppare i segnali, diffondere la soluzione preparata mescolando volumi uguali di ciascun reagente di chemiluminescenza potenziato sulla membrana, prima di trasferire la scheda di imaging al sistema di imaging per l'imaging.