Rilevamento del cotrasportatore neuronale potassio-cloruro 2 fosforilato tramite Western Blotting

Prendi un lisato cellulare contenente il cotrasportatore 2 di cloruro di potassio, o le proteine KCC2, che regolano i livelli di cloruro neuronale.

La fosforilazione nei siti regolatori interrompe la funzione di KCC2, modulando l'attività neuronale.

Aggiungi il lisato alle perle coniugate con anticorpi che hanno come bersaglio KCC2 fosforilato. Incubare per consentire il legame, quindi lavare per rimuovere le proteine non legate e i detriti cellulari.

Trattare con un tampone denaturante ad alta temperatura per rilasciare KCC2, quindi centrifugare per separare le perle.

Carica il surnatante contenente KCC2 su un gel per elettroforesi. Separare le proteine in bande per confermare la presenza di KCC2 fosforilata.

Trasferisci le bande su una membrana, poi incubale in una soluzione bloccante per mascherare siti di legame non specifici.

Incubare con anticorpi primari che hanno come bersaglio KCC2 fosforilato.

Lava, poi incuba con anticorpi secondari marcati con enzimi per etichettare gli anticorpi primari.

Lava di nuovo, poi aggiungi un substrato chemiluminescente, che reagisce con l'enzima per produrre luce.

Misura l'intensità della luce per quantificare il KCC2 fosforilato nel lisato.

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