JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
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Prendi una retina fissata chimicamente isolata dall'occhio di un ratto.
L'occhio mostra danni indotti dal calore al plesso vascolare limbare, una rete di vasi sanguigni che circondano la cornea.
Questo danno blocca il drenaggio dei liquidi, aumentando la pressione intraoculare (IOP) e causando la degenerazione delle cellule gangliari retiniche (RGC).
Tratta la retina con una soluzione di permeabilizzazione per permeabilizzare la cellula e le membrane nucleari.
Applica una soluzione bloccante per prevenire il legame di anticorpi non specifici.
Rimuovi la soluzione di blocco.
Introduci anticorpi primari che hanno come bersaglio un fattore di trascrizione prevalentemente espresso nei RGC.
Lava per rimuovere gli anticorpi non legati.
Introduci anticorpi secondari coniugati con fluorofori che si legano agli anticorpi primari.
Lava per rimuovere gli anticorpi non legati.
Controcolora i nuclei con un colorante legante il DNA.
Lava la retina e montala su un vetrino utilizzando un mezzo di montaggio appropriato.
Visualizza la retina sotto un microscopio a epifluorescenza.
Una ridotta densità cellulare nell'occhio danneggiato rispetto al controllo conferma la degenerazione della RGC dovuta all'aumento della IOP.
Dopo aver isolato le retine, trasferiscile in una piastra di coltura a 24 pozzetti contenente 1 millilitro di PBS, mantenendo la retina interna rivolta verso l'alto. Permeabilizzare il tessuto mediante lavaggio con un tensioattivo non ionico allo 0,5% diluito in PBS. Quindi, incubare il tessuto in soluzione bloccante per un'ora a temperatura ambiente agitando delicatamente. Durante l'incubazione, preparare la soluzione di anticorpi primari BRM 3A e conservarla a 4 gradi Celsius.
Dopo il blocco dei tessuti, incubare le retine in 200 microlitri di soluzione di anticorpi primari a 4 gradi Celsius per 72 ore agitando delicatamente. Quindi, lavare il fazzoletto con PBS. Incubare il tessuto in 200 microlitri della soluzione di anticorpi secondari per due ore a temperatura ambiente, quindi con una soluzione di controcolorazione nucleare per 10 minuti per la colorazione dei nuclei fluorescenti.
Dopo tre lavaggi PBS, trasferisci la retina su un vetrino da microscopio usando due piccoli pennelli, mantenendo il lato vitreo rivolto verso l'alto. Posizionare il quadrante retinico dorsale verso l'alto sul vetrino del microscopio. Infine, applicare 200 microlitri di terreno di montaggio anti-sbiadimento su un vetrino coprioggetti di vetro e posizionarlo sulla retina piatta montata per l'analisi microscopica. Sotto un microscopio confocale a epifluorescenza utilizzando un obiettivo di ingrandimento 40x, esaminare le montature piatte per stimare le cellule gangliari retiniche.