Valutazione dei livelli di neurotrasmettitori eccitatori nei ratti indotti da epilessia cronica

Prendi un ratto di controllo e un ratto indotto da epilessia cronica impiantato con una cannula guida e un elettrodo per elettroencefalogramma, o EEG, nell'ippocampo.

L'induzione dell'epilessia aumenta il rilascio di neurotrasmettitori eccitatori, causando l'afflusso di ioni nelle cellule postsinaptiche, che genera continui potenziali eccitatori. Ciò porta a raffiche sincronizzate di attività elettrica, chiamate convulsioni, registrate utilizzando l'elettrodo.

Inserisci una sonda per microdialisi con una membrana semipermeabile nella cannula.

Legare il topo alla gabbia di un sistema di registrazione EEG.

Infondi un tampone fisiologico nel tessuto cerebrale attraverso l'ingresso della sonda.

Garantisci l'assenza di convulsioni e raccogli il fluido extracellulare attraverso l'uscita della sonda per valutare i livelli di neurotrasmettitore.

Un livello basale elevato nel ratto epilettico indica un aumento mediato dall'epilessia.

Infondi un tampone di potassio alto e raccogli i campioni.

L'aumento del potassio prolunga l'eccitabilità neuronale, innescando il rilascio continuo di neurotrasmettitori.

Un picco temporaneo nei livelli di neurotrasmettitori sia nei ratti epilettici che in quelli di controllo indica un aumento elevato indotto dal potassio.

Iniziare preparando le sonde per microdialisi per il primo utilizzo secondo la guida per l'utente del produttore e riempirle con la soluzione di ringer. Quindi, tagliare pezzi di tubo FEP lunghi 10 centimetri e collegarli alle cannule di ingresso e uscita della sonda, utilizzando gli adattatori per tubi di diversi colori. Assicurarsi che il tubo tocchi gli adattatori senza spazi morti in tutti i collegamenti.

Rimuovere la cannula fittizia dalla sua guida usando le pinzette tenendo saldamente la testa dell'animale. Inserire la sonda per microdialisi nella cannula guida e utilizzare l'argilla da modellare per rassodare ulteriormente la cannula. Quindi, collegare l'animale al sistema di registrazione EEG collegato. Quindi metti l'animale nel cilindro di plexiglas e lascialo esplorare il nuovo ambiente. Segui i movimenti del ratto sveglio e che si muove liberamente.

Quindi, collegare l'ingresso della sonda alla siringa da 2,5 millilitri con un ago smussato calibro 22 contenente la soluzione di ringer utilizzando gli adattatori per tubi. Spingere un millilitro di soluzione di ringer nella sonda in 10 secondi spingendo continuamente il pistone della siringa da 2,5 millilitri. Verificare la presenza di gocce di liquido che appaiono sulla presa per indicare quando la sonda è pronta per l'uso. Infine, riempire le siringhe da 2,5 millilitri collegate al tubo FEP tramite adattatori per tubi con la soluzione di ringer e montarle sulla pompa di infusione. Avviare la pompa a due microlitri al minuto e lasciarla funzionare per una notte.

Dopo aver verificato, tramite registrazioni video EEG, l'assenza di convulsioni nelle tre ore precedenti la raccolta del campione, arrestare la pompa che trasporta il tubo FEP con siringhe cannulate riempite con soluzione di ringer. Montare un altro set di siringhe da 2,5 millilitri collegate al tubo FEP con adattatori per tubi riempiti con una soluzione di ringer modificata contenente 100 millimolari di soluzione di potassio. Avviare la pompa a 2 microlitri al minuto e lasciarla funzionare. Verificare l'assenza di bolle d'aria nel sistema e assicurarsi che il tubo tocchi gli adattatori senza spazi morti in tutti i collegamenti.

Quindi, verificare la presenza di gocce di liquido che appaiono sulla presa per indicare quando la sonda è pronta per l'uso. Quindi, collegare il tubo FEP delle siringhe riempite con la soluzione di ringer alla cannula di ingresso della sonda in ciascun animale e attendere la comparsa della goccia di liquido sulla punta dell'uscita. Collegare l'uscita della sonda al tubo FEP, che porta alla raccolta nella provetta.

Inserire il tubo FEP nella provetta chiusa da 0,2 millilitri con un tappo perforato. E assicurati che il tubo rimanga in posizione fissandolo con un pezzo di argilla da modellare. Dopo aver fatto funzionare la pompa a 2 microlitri al minuto per 60 minuti senza raccogliere campioni per equilibrare, il sistema raccoglie cinque campioni consecutivi di dialisato di 30 minuti in condizioni di base. E conservare i campioni sul ghiaccio.

Dopo 10 minuti, passare il tubo dalle siringhe contenenti 100 millimolari di soluzione di potassio per ringer alla normale soluzione per ringer e lasciare in funzione la pompa. Dopo la raccolta del quinto dialisato post equilibrio, raccogliere 20 microlitri di frazioni di dialisato ogni 10 minuti per un'ora. Quindi raccogliere altri tre campioni di dialisato della durata di 30 minuti e arrestare la pompa. Infine, conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius dopo l'esperimento fino all'analisi HPLC.