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Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:34 min • April 28th, 2025
Prendi un vetrino con una coltura monostrato di cellule endoteliali microvascolari del cervello di ratto, o RBMEC.
Le cellule sono collegate da proteine a giunzione stretta legate al citoscheletro di actina, imitando lo strato endoteliale della barriera emato-encefalica.
Sostituisci il terreno con un mezzo privo di glucosio deossigenato, quindi posiziona il vetrino in una camera di ipossia.
L'indisponibilità di ossigeno e glucosio inibisce la sintesi dell'ATP. L'ATP rimanente viene scomposto in derivati nucleotidici.
La deplezione dell'ATP ostacola le pompe del calcio, aumentando il calcio intracellulare che attiva gli enzimi ossidoreduttasi.
Quindi, riempi con un mezzo ossigenato, quindi posiziona il vetrino in un'incubatrice ossigenata. Le ossidoreduttasi attivate utilizzano l'ossigeno reintrodotto per degradare i derivati nucleotidici, generando specie reattive dell'ossigeno o ROS.
ROS interrompe le interazioni tra le proteine a giunzione stretta e induce vie di segnalazione che rimodellano il citoscheletro di actina in fibre di stress, indebolendo le interazioni cellula-cellula.
Il monostrato con interazioni intercellulari interrotte è pronto per l'analisi.
Durante la preparazione, impostare e calibrare il sistema di coltura cellulare ipossia secondo le istruzioni del produttore. L'ambiente della camera dovrebbe essere composto per il 95% da azoto, per il 5% da anidride carbonica e per 37 gradi Celsius. Ora, deossigenare il dmem privo di glucosio mettendolo nella camera dell'ipossia per 4-6 ore. Successivamente, inizia a stressare le cellule sostituendo il loro terreno con il DMEM deossigenato privo di glucosio. E poi posizionando le cellule nella camera dell'ipossia per due ore. Dopo due ore, rimettere le cellule sul terreno completo delle cellule endoteliali del cervello di ratto. Quindi, riossigenare le cellule riportandole alle condizioni normali per un'ora.