Esecuzione dell'ibridazione in situ a doppia fluorescenza per rilevare l'espressione genica nelle sezioni cerebrali di topo
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 4:06 min. • April 28th, 2025
Prendi una sezione del cervello di topo fissata chimicamente.
Aggiungere una miscela di ibridazione contenente un agente di permeabilizzazione e sonde di RNA marcate con FITC o DIG.
Incubare per consentire la permeabilizzazione cellulare e l'ingresso della sonda.
Le sonde si legano a sequenze complementari sull'mRNA MBP, un marcatore di riferimento espresso ubiquitariamente negli oligodendrociti, o mRNA ASPA, il bersaglio.
Lavare per rimuovere le sonde non legate.
Aggiungere un buffer di blocco per impedire il legame di anticorpi non specifici.
Introdurre gli anticorpi anti-FITC coniugati con HRP che hanno come bersaglio la sonda marcata con FITC.
Lavare, quindi aggiungere la FITC-tirammide.
L'HRP ossida la FITC-tiramide in una forma altamente reattiva che si lega alle proteine vicine, amplificando il segnale di fluorescenza.
Lavare e reintrodurre il tampone di blocco.
Aggiungere anticorpi anti-DIG coniugati con fosfatasi alcalina che hanno come bersaglio la sonda marcata con DIG.
Lavare e applicare la soluzione Fast Red.
La fosfatasi alcalina defosforila Fast Red, producendo un precipitato fluorescente.
Visualizzare al microscopio a fluorescenza.
La co-localizzazione dei segnali Mbp e ASPA indi
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