Immunocolorazione dei neuroni in fette di cervello di topo dopo ibridazione in situ a fluorescenza

Prendi fette di cervello di topo fisse e permeabilizzate contenenti neuroni, inclusi i neuroni colinergici che esprimono colina acetiltransferasi.

Le fette sono sottoposte a ibridazione fluorescente in situ per rilevare mRNA bersaglio localizzati agli assoni colinergici, con conseguente generazione di segnali amplificati utilizzando sonde fluorescenti, che vengono rilevate con la microscopia a fluorescenza.

Aggiungi una soluzione bloccante contenente proteine e un agente estinguente. Le proteine impediscono il legame aspecifico e l'agente estinguente neutralizza i fissativi residui.

Incubare con anticorpi primari che hanno come bersaglio l'acetiltransferasi neuronale della colina.

Lavare con tampone per rimuovere gli anticorpi non legati.

Incubare con anticorpi secondari coniugati con fluorofori che si legano agli anticorpi primari legati alla colina acetiltransferasi.

Lavare con tampone per rimuovere gli anticorpi in eccesso, quindi risciacquare in acqua distillata per rimuovere i residui di tampone.

Monta le fette con un supporto di montaggio contenente una colorazione nucleare per etichettare i nuclei.

Utilizzando la microscopia a fluorescenza, visualizza le fette per visualizzare i segnali mRNA bersaglio e gli assoni colinergici colorati con anticorpi specifici.

Coprire ogni fetta con 100-200 microlitri di soluzione bloccante, contenente tre milligrammi per millilitro di BSA, 100 millimolari di glicina e 0,25% di Triton X-100 in PBS. Coprire ogni vetrino con parafilm e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, a 100-200 microlitri di anticorpo diluito in soluzione bloccante ai vetrini, viene utilizzato un anticorpo anti-colina acetiltransferasi. Dopo la copertura, i vetrini con parafilm, incubano per due giorni a quattro gradi Celsius. Assicurati che le fette di cervello non si secchino. Se necessario, riapplicare la soluzione di anticorpi anti-chAT sulle fette di cervello 24 ore dopo l'incubazione.

Dopo aver lavato i vetrini tre volte in 1X PBS per cinque minuti a temperatura ambiente, aggiungere da 100 a 200 microlitri dell'anticorpo secondario coniugato Alexa appropriato ai vetrini. Coprire con parafilm e incubare per un'ora a temperatura ambiente al riparo dalla luce.

Trascorso l'ora, lavare i vetrini tre volte in 1X PBS per cinque minuti ciascuno come prima, quindi lavare una volta con acqua distillata. Montare le guide con un supporto di montaggio contenente DAPI. E poi visualizzare le fette di cervello al microscopio a fluorescenza.