Name: Saggio basato su cellule di calcio per le medie e High Throughput Screening del PRT Funzioni canale utilizzando FlexStation 3 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Scopri il profilo farmacologico dei canali TRPA1 usando FlexStation 3 con saggi di calcio su cellule HEK 293. Questo metodo ad alto rendimento permette di studiare la modulazione dei canali ionici per applicazioni in farmacologia.

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Ringraziamo Drs. John Hancock, Ray Grill, Andrew Morris e Olga Chumakova per il loro supporto. Il sistema a 3 FlexStation fa parte dello strumento UTHSC Imaging Cytodynamic. Ringraziamo anche Drs. Ardem Patapoutian e Michael Bandell dalla Scripps Research Institute e del Genomics Institute della Novartis Research Foundation (GNF) per fornire la linea cellulare HEK293-hTRPA1 stabile. La ricerca è finanziata in parte dalle concessioni dal NIH (GM081658 a MXZ) e Texas Medical Center Digestive Diseases Center (a SS) e Mission Connect / TIRR Foundation (a SS).

1. Preparazioni di cellule in piastre da 96 pozzetti Per le cellule HEK293 transitoriamente trasfected con TRPA1 umano cDNA <ol><li> HEK293 cellule sono coltivate per uno o due giorni in terreno minimo essenziale Dulbecco (DMEM) contenente 4,5 mg / ml di glucosio (Thermo Scientific, SH3002201), integrato con il 10% di siero siero fetale bovino (Invitrogen, 16000-044), 50 unità / ml di penicillina e 50 mg / ml di streptomicina (Invitrogen, 15140-163). Il giorno della transfezione, la densità cellulare dovrebbe raggiungere il 70-90%. </li><li> Cappotto piastre a 96 pozzetti pipettando 50 microlitri poli-L-ornitina (Sigma P3655, 20 mg / ml in acqua distillata sterile) in ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C per almeno 15 min. Lavare ogni pozzetto una volta con fosfato Dulbecco Buffered Saline (DPBS) senza Mg 2 + e Ca 2 + (Thermo Scientific, SH3002803). La piastra può essere lasciato nel cofano coltura cellulare per qualche ora. </li><li> Per ogni pozzetto di una piastra da 96 pozzetti, diluire in 1,5 ml di tubo Eppendorf 0,2 mcg cDNA in 25 microlitri OPTI-MEM (Invitrogen, 31985-070). Scalare fino proporzionalmente in base al numero di pozzi da transfettate con il cDNA stesso. Anche diluire in un apposito 1,5 ml di tubo Eppendorf 0,4 microlitri Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019) in 25 microlitri OPTI-MEM per ogni bene a essere transfettate. Questa scala fino in base al numero totale di pozzi per essere transfettate. </li><li> Brevemente vortice del 2000 cDNA diluito e Lipofectamine e lasciarli stare alla temperatura ambiente per circa 5 min. </li><li> Trasferire un volume uguale della Lipofectamine diluito 2000 per il tubo che contiene il cDNA diluito, vortex e lasciare che la miscela a temperatura ambiente per 15 minuti a 2 ore. Durante questo tempo, trasferire il cDNA / Lipofectamine 2000 miscela al 49 microlitri / bene al poli-L-ornitina placca rivestita. </li><li> Trypsinize le cellule HEK293 (Punto 1.1), conta la densità delle cellule utilizzando un emocitometro o contatore di cellule contessa automatizzati (Invitrogen, C10227), e trasferire una quantità desiderata di cellule (generalmente circa ~ 125,000-150,000 cellule / pozzetto) a 15 ml sterile conica con fondo provetta da centrifuga. Centrifugare a 1000 RPM x per 5 min. Risospendere le cellule a ~ 1,250,00-1,500,000 cellule / ml nel terreno di coltura DMEM, supplementato con 10% di siero siero fetale bovino, ma senza antibiotici. </li><li> Dispensare 98 microlitri di sospensione cellulare in ogni pozzetto che contiene il cDNA-Lipofectamine 2000 utilizzando una miscela pipetter multicanale o il Dispenser Microplate Microfill (Bio-Tek). Lasciate che la piastra di sedere nel cofano per almeno 30 minuti prima di metterlo alla cultura incubatore umidificato cellulare. Incubare a 37 ° C, 5% di CO 2 per 20-44 ore. </li></ol> Per le cellule HEK293 che esprimono stabilmente TRPA1 <ol start="8"><li> Seguire i passi da 1,2 a cappotto piastre a 96 pozzetti. </li><li> La linea inducibile HEK293-hTRPA1 cella era generosamente fornito dal Dr. A. Patapoutian (The Scripps Research Institute) e mantenuto nel mezzo come il wild-type cellule HEK293 (Punto 1.1) ma integrata con 5 mcg / ml blasticidin (Invitrogen, A1113902) e 50 mg / ml Hygromycin B (Invitrogen, 10687010). Quando densità cellulare raggiunge circa il 90%, trypsinize cellule, conta densità cellulare, e centrifugare la quantità desiderata di cellule a 1000 x RPM per 5 min. Risospendere le cellule ad una densità di circa 1.000.000 cellule / ml nel terreno di coltura stesso integrato con doxiciclina (Fisher, BP26535, 0,25 mg / ml). </li><li> Dispensare la sospensione cellulare rivestito di lastre di poli-L-ornitina a 100 l / pozzetto utilizzando una pipetter multicanale o il Microfill (Bio-Tek). Lasciate che la piastra di sedere nel cofano per almeno 30 minuti prima di metterlo alla cultura incubatore umidificato cellulare. Incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 16 - 24 ore. </li></ol> 2. Soluzioni <ol><li> Soluzione salina tamponata di Hank (HBSS) è usato come soluzione extracellulare. Esso contiene (in mm): 137 NaCl, 5.4 KCl, 0,25 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 1,3 CaCl 2, 1,0 MgSO 4, 1,0 MgCl 2, 10 di glucosio, 10 HEPES, con pH regolato a 7,4 con NaOH 1N). </li><li> Fluo-4 tampone contiene 2 mM probenecid in HBSS. Fai 250 mm magazzino probenecid (Sigma, P8761) in 0,5 N NaOH. Diluire a HBSS con un rapporto di 1:125. Regolare il pH a 7,4 con 1 N HCl. </li></ol> 3. Celle di carico con Fluo-04:00 <ol><li> Sciogliere 1 mg Fluo-4 AM (Invitrogen, F14202) nel 912 microlitri di DMSO anidro per ottenere una soluzione stock di 1 mM. Il Fluo-4:00 soluzione madre può essere conservata a -20 ° C per almeno un mese. </li><li> Mix 10 microlitri 1 mM-Fluo 04:00 con 10 microlitri Pluronic F-127 (Invitrogen, P3000MP, 20% (w / v) in DMSO) e poi trasferire l'intero contenuto di 5 ml Fluo-4 tampone (Step 2.2) integrato con 0,1% di albumina sierica bovina (Sigma, A9418). </li><li> Lavare le cellule coltivate in piastre a 96 pozzetti (passo 1,7 o 1,10) con HBSS a 80 microlitri / ben 2 volte con una rondella di micropiastre (come ELx405TM da Bio-Tek). </li><li> Aggiungere il Fluo-4 AM carico soluzione (Fase 3.2) a 50 microlitri / pozzetto utilizzando una pipetter multicanale o il Microfill (Bio-Tek) e incubare la piastra a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Lavare le cellule 3 volte con il Fluo-4 tampone (Punto 2.2.) Utilizzando la rondella micropiastre ELx405TM. Dopo l'ultimo lavaggio, lasciare 80 ml di buffer di Fluo-4 test in ciascun pozzetto. </li></ol> 4. Preparazione del piatto composto <ol><li> Durante il periodo 1 cella di carico ora, preparare una serie di diluizioni 3x di agonisti (o antagonisti) di 3x delle concentrazioni finale desiderato nel buffer di Fluo-4 test. </li><li> Pipetta 250-300 ml di soluzioni composto diluito ad una piastra composto da 96 pozzetti. Provvede alla traduzione della diluizioni seriali di un composto e dei controlli positivo e negativo corrispondente nella stessa colonna del piatto composto ogni volta che è possibile perché FlexStation 3 recita una colonna alla volta. </li></ol> 5. Di lettura targhe in FlexStation 3 <ol><li> Accendere il sistema (FlexStation 3, computer e il SoftMax Pro 5.2 del software) </li><li> Salva l'esperimento con un nuovo nome. Al set-up, scegliere la modalità FLEX e immettere i seguenti valori: </li></ol> Protocollo n. 1, effetto agonista <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table1.jpg" alt="Tabella 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Tabella 1"> Protocollo n. 2, effetto antagonista <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table2.jpg" alt="Tabella 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Tabella 2"><ol start="3"><li> Inserire una nuova casella punta, piatto composto e la piastra di lettura per i vassoi appropriato in FlexStation 3 e fare clic sul pulsante "leggere". Il FlexStation 3 sarà letta una colonna alla volta e aggiungere composti nei punti di tempo programmato senza interrompere la lettura. Ci vogliono circa 3 minuti (5 min per il protocollo # 2) per finire di leggere una colonna e la macchina continua a leggere la colonna successiva, con aggiunte composto eseguito come programmato dall'utente al passo 5,2 fino a quando tutte le colonne vengono letti. </li></ol> 6. Analisi dei dati <ol><li> I dati sperimentali possono essere trattati direttamente con il SoftMax Pro 5.2 del software o copiato e incollato in qualsiasi programma di foglio di calcolo, come Microsoft Excel. Curva concentrazione-risposta di un acido TRPA1 agonista flufenamic (FFA), è costruito utilizzando i seguenti minimi quadrati routine di montaggio. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq1.jpg" alt="Equazione 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Equazione 1"> , Dove Y è la risposta osservata, Y max è la risposta normalizzata massima, C è la concentrazione del farmaco corrispondente, CE 50 è la concentrazione che evoca una mezza massima risposta, e n H è il coefficiente di Hill apparente. Concentrazione di inibizione curva per un presunto TRPA1 composto antagonista A è ottenuta utilizzando una concentrazione fissa di FFA (100 micron), e progressivamente aumentando la concentrazione di A. composto IC 50 Valore del composto A si calcola minimi quadrati al seguente equazione. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq2.jpg" alt="Equazione 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Equazione 2"> , Dove Y è la risposta osservata e Y max è normalizzata risposta di picco, [Ant] è il composto corrispondente A di concentramento, IC 50 è la concentrazione di antagonista che produce la metà-massimale inibizione della FFA-risposta evocata e n H è la collina apparente coefficiente. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: TRPA1 è un +-permeabile canale catione Ca 2, l'attivazione dei quali porta a afflusso di calcio che può essere rilevato dal Ca 2 +-sensitive colorante, Fluo-4 (1-2). Una linea cellulare HEK293-hTRPA1 stabile è stato utilizzato per studiare la concentrazione-risposta di TRPA1 agonisti e antagonisti. Le cellule sono state caricate con Fluo-4 AM, posto in 80 microlitri della tampone, e leggere con FlexStation 3. Dopo aver registrato la fluorescenza di base per 30 s, 40 ml di una diluizione di serie del agonista TRPA1, FFA, ciascuno a 3 volte la concentrazione finale desiderata, sono stati aggiunti alle cellule attraverso un multi-canale pipetter incluso come parte del modulo fluidica di FlexStation 3. I cambiamenti fluorescenza sono stati monitorati per ulteriori 180 s. Le variazioni relative Fluo-4 fluorescenza per ciascun pozzetto sono stati espressi come ΔF = (F - F 0), dove 0 F e F sono i valori di fluorescenza, al momento di interesse e l'inizio della lettura, rispettivamente. Tracce rappresentante dei corsi tempo ai cambiamenti fluorescenza in risposta ad una serie di concentrazioni di FFA sono mostrati in fig. 1. Nota per le ultime quattro concentrazioni di FFA, anche se i livelli di risposta massima sono simili, la cinetica di attivazione è chiaramente più veloce al superiore alle concentrazioni inferiori FFA. Pertanto, per distinguere queste differenze, la concentrazione - relazione dose-risposta è stato costruito misurando i tassi iniziali (pendenza) di aumento di fluorescenza dopo l'aggiunta di varie concentrazioni di FFA (Fig. 2). L'effetto mezzo massimoconcentrazione ive (CE 50) di FFA è stato determinato in 55,4 mM (n = 3). Per testare la putativo TRPA1 antagonista, composto A, abbiamo effettuato un esperimento simile con protocollo n. 2 (punto 2). In questo caso, una serie di diluizioni del antagonista sono stati aggiunti a 30 s (40 ml di 3x concentrazione finale desiderata) e il FFA è stato aggiunto dopo 180 s (60 microlitri a 300 mM per una concentrazione finale di 100 mM). Composto A dose-dipendente ridotto la risposta delle cellule TRPA1 di FFA con una mezza massima concentrazione inibente (IC 50) di 4,3 mM (n = 3) (Fig. 2). <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Concentrazione-dipendente l'attivazione di TRPA1 umani da parte di FFA. Le tracce sono aumentare FFA-evocato di fluorescenza nel tempo (risposta solo nei primi 60 s vengono mostrati per illustrare meglio la cinetica veloce del FFA-evocate risposte). Si informa che alle alte concentrazioni di FFA evocato aumento di fluorescenza con una cinetica molto più veloce rispetto a concentrazioni inferiori, anche se i livelli di picco di fluorescenza erano simili. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 Concentrazione -. Relazioni risposta per FFA cambiamento indotto fluorescenza e composto A indotta inibizione della risposta FFA umani TRPA1 stabilmente espressi in cellule HEK293. Δ, la concentrazione - relazione dose-risposta di FFA è stata determinata misurando il tasso iniziale (pendenza) di aumento di fluorescenza normalizzata dopo l'aggiunta di varie concentrazioni di FFA. O, concentrazione-risposta di inibizione della FFA-evocata risposta di calcio da un presunto TRPA1 antagonista, composto A.

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<li>Nanda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+of+adrenergic+receptors+by+measuring+intracellular+calcium+using+the+FlexStation+scanning+fluorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter.</a> Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Intracellulare di Ca 2 + gioca un ruolo importante in molte condizioni fisiologiche e patologiche, quali rilascio dei neurotrasmettitori (3), potenziale d&#39;azione cardiaco (4), la contrazione delle cellule muscolari (5), trasduzione del segnale cellulare (6-7), e la morte cellulare eccitotossico ( 8). Misura di Ca 2 + intracellulare livelli aiuta a chiarire cambiamenti funzionali di Ca 2 +-permeabile canali nella membrana plasmatica o organelli intracellulari e il contributo di ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> FlexStation 3 </td><td> Molecular Devices </td><td> FLEX3 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Beh, FlexStation Pipettare Consigli </td><td> Molecular Devices </td><td> 9000-0912 </td><td></td></tr><tr><td> Piastre a 96 pozzetti </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 655090 </td><td></td></tr><tr><td> 96-ben chiaro piastre a fondo piatto </td><td> Co-star </td><td> 3595 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12430-104 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-019 </td><td></td></tr><tr><td> Fluo, 04:00 </td><td> Invitrogen </td><td> F14202 </td><td></td></tr><tr><td> PluronicF-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-ornitina </td><td> Sigma </td><td> P36551 </td><td></td></tr><tr><td> probenecid </td><td> Sigma </td><td> P8761 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td></td></tr></tbody></table>

saggio basato su cellule di calcio per le medie e high throughput screening del prt funzioni canale utilizzando flexstation 3

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

FlexStation il Molecular Devices &#39;3 è un banco di lavoro multi-mode capaci di lettore per micropiastre automatico di misurazione della fluorescenza multi-pozzetti. E &#39;ideale per medie e high-throughput schermi in ambienti accademici. Ha un modulo integrato di trasferimento del liquido dotato di un multi-canale pipetter e la macchina legge una colonna alla volta per monitorare le variazioni di fluorescenza di una varietà di reagenti fluorescenti. Per esempio, FlexStation 3 è stato usato per studiare la funzione di Ca 2 +-permeabile canali ionici e G-proteine ​​recettori accoppiati misurando le variazioni di libero intracellulare di Ca 2 + livelli. Transitori recettore potenziale (TRP) i canali sono una grande famiglia di canali di comunicazione non selettivi che svolgono un ruolo importante in molte funzioni fisiologiche e fisiopatologiche. La maggior parte dei canali TRP sono il calcio permeabili e indurre influsso di calcio al momento dell&#39;attivazione. In questo video, dimostriamo l&#39;applicazione di FlexStation 3 a studiare il profilo farmacologico del canale TRPA1, un sensore molecolare per numerosi stimoli nocivi. Cellule HEK293 transitoriamente o stabilmente esprimere umano TRPA1 canali, coltivate in piastre a 96 pozzetti, vengono caricati con Ca 2 +-sensitive colorante fluorescente, Fluo-4, e le modifiche fluorescenza in tempo reale in queste cellule sono misurati prima e durante l&#39;applicazione di un agonista TRPA1 utilizzando la modalità FLEX del FlexStation 3. L&#39;effetto di un putativo TRPA1 antagonista stato anche esaminato. I dati vengono trasferiti dal software SoftMax Pro per la costruzione di concentrazione-risposta di TRPA1 attivatori e inibitori.

Questo video fornisce un protocollo dettagliato per lo studio del profilo farmacologico di umano TRPA1 canali utilizzando FlexStation 3. Il protocollo comprende dettagli di preparazione delle cellule, il caricamento colorante e il funzionamento del lettore per micropiastre, FlexStation 3.

Saggio basato su cellule di calcio per le medie e High Throughput Screening del PRT Funzioni canale utilizzando FlexStation 3

Il FlexStation 3 di Molecular Devices è un lettore di microplate multifunzione da banco in grado di eseguire misurazioni di fluorescenza automatizzate in piastre multiwell. È...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare l'applicazione del Flex Station Three per studiare il profilo farmacologico del canale del recettore potenziale transitorio, o TRPA1. Questo viene realizzato preparando innanzitutto cellule che esprimono canali TRPA1 in piastre microtitolazione da 96 pozzetti.Dopo aver lavato le cellule in un lavatore per micropiastre, le cellule vengono caricate con il colorante fluorescente sensibile al calcio. Flu oh 4:00 AM un periodo di caricamento cellulare è quindi seguito da diversi ulteriori lavaggi. Il passaggio successivo della procedura consiste nel preparare la piastra dei composti, inclusi un agonista trip a uno e un antagonista putativo trip a uno.Come passaggio finale, si configurano i parametri del software per la lettura della piastra nel sistema Flex Station three. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano relazioni dose-risposta per l'attivazione di trip A uno indotta dall'acido flu fonemico e l'inibizione da parte del composto antagonista A. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui meccanismi di attivazione del 21 mediante la misurazione dell'ingresso di calcio, può essere applicato anche allo studio delle funzioni di altri canali ionici permeabili al calcio e di recettori accoppiati a proteine G utilizzando coloranti sensibili al calcio come i frozen dye o i coloranti per il potenziale di membrana.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'imaging al calcio e la mappatura manuale con patch è che questo metodo risparmia tempo e consente uno screening ad alto rendimento della funzione e della modulazione del calcio, dei canali del ferro e di altri recettori mobilitanti il calcio. Prima di iniziare questo protocollo, coltivare cellule HEC 293 stabilmente trasfettate con trip A uno fino a una densità del 70-90%, come descritto nel protocollo scritto. Per iniziare la preparazione delle cellule per il saggio del calcio, rivestire le piastre a 96 pozzetti pipettando 50 microlitri di poli-L-ornitina in ciascun pozzetto e incubare le piastre a 37 gradi Celsius per almeno 15 minuti.Dopo l'incubazione, risciacquare le cellule una volta con soluzione salina tamponata al fosfato di KO. Dopo la tripsina, trasferire la quantità desiderata di cellule HEC 293 in un tubo conico sterile da 15 millilitri e centrifugare il campione. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet cellulare risultante.Nel mezzo di coltura DMEM integrato con siero fetale bovino inattivato al 10%, distribuire 100 microlitri di sospensione cellulare in ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Utilizzando una pipetta multicanale, lasciare riposare la piastra nell'incubatrice per almeno 30 minuti prima di posizionarla nell'incubatore cellulare umidificato per 20-44 ore. Per la preparazione del saggio del calcio, preparare innanzitutto le soluzioni come descritto nel protocollo scritto.Dopo averlo preparato, mescolare 10 microlitri di flu oh 4:00 AM uno millimolare con 10 microlitri di onic. F1 27, quindi trasferire l'intero contenuto in cinque millilitri di tampone per saggio flu. Oh quattro integrato con lo 0,1% di albumina sierica bovina.Successivamente, lavare le cellule coltivate in piastre a 96 pozzetti con HBSS a 80 microlitri per pozzetto, due volte, utilizzando un lavatore per micropiastre. Dopo il lavaggio, aggiungere la soluzione di carico flu oh 4:00 AM a 50 microlitri per pozzetto mediante un pipettatore multicanale e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora. Durante il periodo di carico cellulare di un'ora, preparare una serie di soluzioni tre volte concentrate di agonisti, una serie di soluzioni tre volte concentrate di antagonisti e un volume elevato di agonista 300 micromolare nel buffer per saggio flu oh quattro, utilizzando la pipetta.300 microlitri delle soluzioni del composto diluito in una piastra per composti a 96 pozzetti. Disporre in modo da avere la diluizione seriale di un composto e i corrispondenti controlli positivo e negativo nella stessa colonna della piastra per composti, ogni volta che possibile. Poiché il Flex station three legge una singola colonna alla volta, pipettare 300 microlitri della soluzione di agonista a 300 micromolari accanto a ciascun pozzetto contenente l'antagonista come passaggio finale di preparazione delle cellule.Lavare le cellule caricate tre volte con il tampone acido flu oh quattro utilizzando il lavatore a micropiastre dopo l'ultimo lavaggio. Lasciare 80 microlitri di tampone acido flu oh quattro in ogni pozzetto. Per iniziare la lettura della piastra, accendere il sistema Flex Station tre e avviare il software Soft Max Pro 5.2.Salvare l'esperimento con un nuovo nome di file durante la configurazione. Selezionare la modalità flex e impostare i parametri per misurare l'effetto dell'agonista e dell'antagonista come indicato nella procedura scritta. Successivamente, posizionare una nuova cassetta di punte, la piastra dei composti e la piastra di lettura nei vassoi appropriati della stazione Flex.Three.Avviare la lettura della piastra cliccando sul pulsante di lettura nel software Soft Max Pro. Il Flex Station tre leggerà una colonna alla volta e aggiungerà i composti nei punti temporali preprogrammati senza interrompere la lettura. Al termine dell'esecuzione, i dati sperimentali possono essere elaborati direttamente utilizzando il software Soft Max PRO oppure copiati e incollati in qualsiasi programma di foglio elettronico, come Microsoft Excel.Per analizzare i dati, generare curve di risposta alla concentrazione per l'agonista trip a one, l'acido flu fonemico, e per il presunto composto antagonista trip a one, il composto A, utilizzando un adattamento ai minimi quadrati come descritto nella procedura scritta trip. Trip a one è un canale cationico permeabile al calcio il cui attivazione provoca un ingresso di calcio rilevabile mediante il colorante sensibile al calcio flu oh 4:00 AM. Tracce rappresentative dei profili temporali delle variazioni di fluorescenza in risposta a una serie di concentrazioni di acido flu fonemico o FFA sono mostrate a concentrazioni più elevate. L'FFA induce aumenti di fluorescenza con una cinetica molto più rapida rispetto a concentrazioni più basse, nonostante livelli di picco di fluorescenza simili.Per distinguere queste differenze, la relazione concentrazione-risposta è stata costruita misurando le velocità iniziali dell'aumento della fluorescenza. Dopo l'aggiunta di concentrazioni variabili di FFA, la concentrazione efficace massima al 50% di FFA è risultata pari a 55,4 micromolare. È inoltre mostrata la relazione concentrazione-risposta dell'inibizione della risposta al calcio indotta da FFA da parte di un presunto antagonista del recettore TRPA1, il composto A.Una dose ha ridotto in modo indipendente la risposta delle cellule triplo A uno all'FFA con una concentrazione inibitoria massima al 50% di 4,3 micromolare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come studiare i profili farmacologici dei canali triplo A uno e quelli correlati utilizzando la flag station tre.

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Imaging locale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Segnali in cellule di mammifero coltivate

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Monitoraggio del rilascio di Calcio di ER / SR con la Targeted Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensore CatchER<sup&gt; +</sup

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