Saggio basato su cellule di calcio per le medie e High Throughput Screening del PRT Funzioni canale utilizzando FlexStation 3

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare l'applicazione della Flex Station 3 per studiare il profilo farmacologico del potenziale recettoriale transitorio o del trip a un canale. Ciò si ottiene preparando prima le cellule che esprimono il viaggio di un canale in 96. Piastre per microtitolazione del pozzo.

Dopo aver lavato le cellule in una lavatrice per micropiastre, le cellule vengono caricate con il colorante fluorescente sensibile al calcio. Influenza oh 4:00 AM un periodo di carico cellulare è quindi seguito da diversi lavaggi aggiuntivi. Il passo successivo della procedura consiste nel preparare la piastra composta, compreso un viaggio, un agonista e un presunto viaggio, un antagonista.

Come passaggio finale, i parametri del software vengono impostati per la lettura delle lastre nel sistema Flex Station three. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano relazioni dose-risposta per l'attivazione del viaggio A da parte dell'acido fonemico dell'influenza e l'inibizione da parte del composto antagonista A. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni su 21 meccanismi di attivazione misurando l'afflusso di calcio. Può anche essere applicato per studiare le funzioni di altri canali oculari permeabili al calcio e recettori profondi accoppiati a proteine utilizzando coloranti congelati sensibili al calcio o coloranti per il potenziale malibeo.

Il vantaggio principale di questa tattica rispetto ai metodi esistenti come l'imaging del calcio e la mappatura manuale dei cerotti è che questa tecnica che consente di risparmiare tempo fornisce uno screening ad alta produttività per la funzione e la modulazione della formula del calcio, dei canali del ferro e di altri recettori mobilizzanti del ca. Prima dell'inizio di questo protocollo, crescere 2.93 cellule HEC trasfettate stabilmente con il trip A uno a una densità dal 70 al 90%, come descritto nel protocollo scritto. Per iniziare la preparazione delle cellule per il saggio del calcio, rivestire le piastre da 96 pozzetti pipettando 50 microlitri di poli L-ornitina in ciascun pozzetto, incubare le piastre a 37 gradi Celsius per almeno 15 minuti.

Dopo l'incubazione, sciacquare le cellule una volta con soluzione salina tamponata con fosfato di KO Dopo la tripsina, le cellule HEC 2 93 trasferiscono la quantità desiderata di cellule in una provetta a fondo conico sterile da 15 millilitri e centrifugano. Il campione. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare risultante.

Nel terreno di coltura DMEM, integrato con siero fetale bovino inattivato al 10% di calore, erogare 100 microlitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti. Utilizzando un pipettatore multicanale, lasciare riposare la piastra nella cappa per almeno 30 minuti prima di metterla nell'incubatore per colture cellulari umidificate per 20-44 ore. Per la preparazione del saggio del calcio, preparare prima le soluzioni come descritto nel protocollo scritto.

Una volta preparato, mescolare 10 microlitri di un millimolare di influenza alle 4:00 del mattino con 10 microlitri di onic. F1 27, trasferire l'intero contenuto a cinque millilitri di influenza. Oh quattro tampone di saggio integrato con albumina sierica bovina allo 0,1%.

Successivamente, lavare le cellule cresciute in 96. Piastre a pozzetti con HBSS a 80 microlitri per pozzetto due volte utilizzando una lavatrice per micropiastre dopo il lavaggio, aggiungere la soluzione di carico dell'influenza alle 4:00 del mattino a 50 microlitri per pozzetto con un pipettatore multicanale e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora. Durante il periodo di caricamento cellulare di un'ora, preparare una serie di tre soluzioni di agonisti, una serie di tre soluzioni di antagonisti e un grande volume di agonisti da 300 micromolari nella pipetta tampone a quattro saggi per l'influenza.

300 microlitri di soluzioni composte diluite in una piastra composta a 96 pozzetti. Organizzare la diluizione seriale di un composto e i corrispondenti controlli positivi e negativi nella stessa colonna della piastra del composto, quando possibile. Mentre la stazione Flex tre legge una singola colonna alla volta, quindi pipettare 300 microlitri della soluzione agonista da 300 micromolari adiacente a ciascun pozzetto contenente l'antagonista come fase finale di preparazione della cellula.

Lavare le cellule caricate tre volte con il tampone acido flu oh four utilizzando la lavatrice per micropiastre dopo l'ultimo lavaggio. Lasciare 80 microlitri di tampone acido per l'influenza o quattro in ogni pozzetto. Per iniziare la lettura delle lastre, accendere il sistema Flex Station tre e visualizzare il software soft max Pro 5.2.

Salvare l'esperimento con un nuovo nome file durante l'installazione. Scegli la modalità flex e inserisci i parametri per misurare l'effetto agonista e antagonista come elencato nella procedura scritta. Posizionare quindi una nuova scatola di puntali, la piastra composta e la piastra di lettura negli appositi vassoi della stazione flessibile. Tre.

Iniziare la lettura delle lastre facendo clic sul pulsante di lettura nel software Soft Max Pro. La Flex Station tre leggerà una colonna alla volta e aggiungerà composti ai punti temporali pre-programmati senza interrompere la lettura. Una volta completata la corsa, i dati sperimentali possono essere elaborati direttamente utilizzando il software Soft Max PRO o copiati e incollati in qualsiasi programma di fogli di calcolo come Microsoft Excel.

Per analizzare i dati, generare curve concentrazione-risposta per il viaggio, un agonista dell'acido fonemico influenzale, e per il presunto viaggio un composto antagonista a utilizzando l'adattamento dei minimi quadrati come descritto nella procedura scritta di viaggio. Uno è un canale cationico permeabile al calcio la cui attivazione porta all'afflusso di calcio che può essere rilevato dall'influenza del colorante sensibile al calcio oh 4:00 AM. Tracce rappresentative dei corsi temporali delle variazioni di fluorescenza in risposta a una serie di concentrazioni di acido fonemico influenzale o FFA sono mostrate a concentrazioni più elevate. La fluorescenza evocata da FFA aumenta con una cinetica molto più veloce rispetto a concentrazioni più basse, nonostante livelli di fluorescenza di picco simili.

Per distinguere queste differenze, la relazione concentrazione-risposta è stata costruita misurando i tassi iniziali di aumento della fluorescenza. Dopo l'aggiunta di varie concentrazioni di FFA, la concentrazione efficace semimassima di FFA è stata determinata in 55,4 micromolari. Viene mostrata anche la relazione concentrazione-risposta di risposta di calcio evocata da un presunto viaggio di un composto antagonista A.

Una dose ha ridotto in modo indipendente la risposta del trip A di una cellula all'FFA con una concentrazione inibitoria massima dimezzata di 4,3 micromolari. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare i profili farmacologici della tripla A uno e dei canali correlati utilizzando la stazione di bandiera tre.