Name: Saggio basato su cellule di calcio per le medie e High Throughput Screening del PRT Funzioni canale utilizzando FlexStation 3 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Scopri il profilo farmacologico dei canali TRPA1 usando FlexStation 3 con saggi di calcio su cellule HEK 293. Questo metodo ad alto rendimento permette di studiare la modulazione dei canali ionici per applicazioni in farmacologia.

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Ringraziamo Drs. John Hancock, Ray Grill, Andrew Morris e Olga Chumakova per il loro supporto. Il sistema a 3 FlexStation fa parte dello strumento UTHSC Imaging Cytodynamic. Ringraziamo anche Drs. Ardem Patapoutian e Michael Bandell dalla Scripps Research Institute e del Genomics Institute della Novartis Research Foundation (GNF) per fornire la linea cellulare HEK293-hTRPA1 stabile. La ricerca è finanziata in parte dalle concessioni dal NIH (GM081658 a MXZ) e Texas Medical Center Digestive Diseases Center (a SS) e Mission Connect / TIRR Foundation (a SS).

1. Preparazioni di cellule in piastre da 96 pozzetti Per le cellule HEK293 transitoriamente trasfected con TRPA1 umano cDNA <ol><li> HEK293 cellule sono coltivate per uno o due giorni in terreno minimo essenziale Dulbecco (DMEM) contenente 4,5 mg / ml di glucosio (Thermo Scientific, SH3002201), integrato con il 10% di siero siero fetale bovino (Invitrogen, 16000-044), 50 unità / ml di penicillina e 50 mg / ml di streptomicina (Invitrogen, 15140-163). Il giorno della transfezione, la densità cellulare dovrebbe raggiungere il 70-90%. </li><li> Cappotto piastre a 96 pozzetti pipettando 50 microlitri poli-L-ornitina (Sigma P3655, 20 mg / ml in acqua distillata sterile) in ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C per almeno 15 min. Lavare ogni pozzetto una volta con fosfato Dulbecco Buffered Saline (DPBS) senza Mg 2 + e Ca 2 + (Thermo Scientific, SH3002803). La piastra può essere lasciato nel cofano coltura cellulare per qualche ora. </li><li> Per ogni pozzetto di una piastra da 96 pozzetti, diluire in 1,5 ml di tubo Eppendorf 0,2 mcg cDNA in 25 microlitri OPTI-MEM (Invitrogen, 31985-070). Scalare fino proporzionalmente in base al numero di pozzi da transfettate con il cDNA stesso. Anche diluire in un apposito 1,5 ml di tubo Eppendorf 0,4 microlitri Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019) in 25 microlitri OPTI-MEM per ogni bene a essere transfettate. Questa scala fino in base al numero totale di pozzi per essere transfettate. </li><li> Brevemente vortice del 2000 cDNA diluito e Lipofectamine e lasciarli stare alla temperatura ambiente per circa 5 min. </li><li> Trasferire un volume uguale della Lipofectamine diluito 2000 per il tubo che contiene il cDNA diluito, vortex e lasciare che la miscela a temperatura ambiente per 15 minuti a 2 ore. Durante questo tempo, trasferire il cDNA / Lipofectamine 2000 miscela al 49 microlitri / bene al poli-L-ornitina placca rivestita. </li><li> Trypsinize le cellule HEK293 (Punto 1.1), conta la densità delle cellule utilizzando un emocitometro o contatore di cellule contessa automatizzati (Invitrogen, C10227), e trasferire una quantità desiderata di cellule (generalmente circa ~ 125,000-150,000 cellule / pozzetto) a 15 ml sterile conica con fondo provetta da centrifuga. Centrifugare a 1000 RPM x per 5 min. Risospendere le cellule a ~ 1,250,00-1,500,000 cellule / ml nel terreno di coltura DMEM, supplementato con 10% di siero siero fetale bovino, ma senza antibiotici. </li><li> Dispensare 98 microlitri di sospensione cellulare in ogni pozzetto che contiene il cDNA-Lipofectamine 2000 utilizzando una miscela pipetter multicanale o il Dispenser Microplate Microfill (Bio-Tek). Lasciate che la piastra di sedere nel cofano per almeno 30 minuti prima di metterlo alla cultura incubatore umidificato cellulare. Incubare a 37 ° C, 5% di CO 2 per 20-44 ore. </li></ol> Per le cellule HEK293 che esprimono stabilmente TRPA1 <ol start="8"><li> Seguire i passi da 1,2 a cappotto piastre a 96 pozzetti. </li><li> La linea inducibile HEK293-hTRPA1 cella era generosamente fornito dal Dr. A. Patapoutian (The Scripps Research Institute) e mantenuto nel mezzo come il wild-type cellule HEK293 (Punto 1.1) ma integrata con 5 mcg / ml blasticidin (Invitrogen, A1113902) e 50 mg / ml Hygromycin B (Invitrogen, 10687010). Quando densità cellulare raggiunge circa il 90%, trypsinize cellule, conta densità cellulare, e centrifugare la quantità desiderata di cellule a 1000 x RPM per 5 min. Risospendere le cellule ad una densità di circa 1.000.000 cellule / ml nel terreno di coltura stesso integrato con doxiciclina (Fisher, BP26535, 0,25 mg / ml). </li><li> Dispensare la sospensione cellulare rivestito di lastre di poli-L-ornitina a 100 l / pozzetto utilizzando una pipetter multicanale o il Microfill (Bio-Tek). Lasciate che la piastra di sedere nel cofano per almeno 30 minuti prima di metterlo alla cultura incubatore umidificato cellulare. Incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 16 - 24 ore. </li></ol> 2. Soluzioni <ol><li> Soluzione salina tamponata di Hank (HBSS) è usato come soluzione extracellulare. Esso contiene (in mm): 137 NaCl, 5.4 KCl, 0,25 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 1,3 CaCl 2, 1,0 MgSO 4, 1,0 MgCl 2, 10 di glucosio, 10 HEPES, con pH regolato a 7,4 con NaOH 1N). </li><li> Fluo-4 tampone contiene 2 mM probenecid in HBSS. Fai 250 mm magazzino probenecid (Sigma, P8761) in 0,5 N NaOH. Diluire a HBSS con un rapporto di 1:125. Regolare il pH a 7,4 con 1 N HCl. </li></ol> 3. Celle di carico con Fluo-04:00 <ol><li> Sciogliere 1 mg Fluo-4 AM (Invitrogen, F14202) nel 912 microlitri di DMSO anidro per ottenere una soluzione stock di 1 mM. Il Fluo-4:00 soluzione madre può essere conservata a -20 ° C per almeno un mese. </li><li> Mix 10 microlitri 1 mM-Fluo 04:00 con 10 microlitri Pluronic F-127 (Invitrogen, P3000MP, 20% (w / v) in DMSO) e poi trasferire l'intero contenuto di 5 ml Fluo-4 tampone (Step 2.2) integrato con 0,1% di albumina sierica bovina (Sigma, A9418). </li><li> Lavare le cellule coltivate in piastre a 96 pozzetti (passo 1,7 o 1,10) con HBSS a 80 microlitri / ben 2 volte con una rondella di micropiastre (come ELx405TM da Bio-Tek). </li><li> Aggiungere il Fluo-4 AM carico soluzione (Fase 3.2) a 50 microlitri / pozzetto utilizzando una pipetter multicanale o il Microfill (Bio-Tek) e incubare la piastra a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Lavare le cellule 3 volte con il Fluo-4 tampone (Punto 2.2.) Utilizzando la rondella micropiastre ELx405TM. Dopo l'ultimo lavaggio, lasciare 80 ml di buffer di Fluo-4 test in ciascun pozzetto. </li></ol> 4. Preparazione del piatto composto <ol><li> Durante il periodo 1 cella di carico ora, preparare una serie di diluizioni 3x di agonisti (o antagonisti) di 3x delle concentrazioni finale desiderato nel buffer di Fluo-4 test. </li><li> Pipetta 250-300 ml di soluzioni composto diluito ad una piastra composto da 96 pozzetti. Provvede alla traduzione della diluizioni seriali di un composto e dei controlli positivo e negativo corrispondente nella stessa colonna del piatto composto ogni volta che è possibile perché FlexStation 3 recita una colonna alla volta. </li></ol> 5. Di lettura targhe in FlexStation 3 <ol><li> Accendere il sistema (FlexStation 3, computer e il SoftMax Pro 5.2 del software) </li><li> Salva l'esperimento con un nuovo nome. Al set-up, scegliere la modalità FLEX e immettere i seguenti valori: </li></ol> Protocollo n. 1, effetto agonista <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table1.jpg" alt="Tabella 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Tabella 1"> Protocollo n. 2, effetto antagonista <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table2.jpg" alt="Tabella 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Tabella 2"><ol start="3"><li> Inserire una nuova casella punta, piatto composto e la piastra di lettura per i vassoi appropriato in FlexStation 3 e fare clic sul pulsante "leggere". Il FlexStation 3 sarà letta una colonna alla volta e aggiungere composti nei punti di tempo programmato senza interrompere la lettura. Ci vogliono circa 3 minuti (5 min per il protocollo # 2) per finire di leggere una colonna e la macchina continua a leggere la colonna successiva, con aggiunte composto eseguito come programmato dall'utente al passo 5,2 fino a quando tutte le colonne vengono letti. </li></ol> 6. Analisi dei dati <ol><li> I dati sperimentali possono essere trattati direttamente con il SoftMax Pro 5.2 del software o copiato e incollato in qualsiasi programma di foglio di calcolo, come Microsoft Excel. Curva concentrazione-risposta di un acido TRPA1 agonista flufenamic (FFA), è costruito utilizzando i seguenti minimi quadrati routine di montaggio. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq1.jpg" alt="Equazione 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Equazione 1"> , Dove Y è la risposta osservata, Y max è la risposta normalizzata massima, C è la concentrazione del farmaco corrispondente, CE 50 è la concentrazione che evoca una mezza massima risposta, e n H è il coefficiente di Hill apparente. Concentrazione di inibizione curva per un presunto TRPA1 composto antagonista A è ottenuta utilizzando una concentrazione fissa di FFA (100 micron), e progressivamente aumentando la concentrazione di A. composto IC 50 Valore del composto A si calcola minimi quadrati al seguente equazione. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq2.jpg" alt="Equazione 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Equazione 2"> , Dove Y è la risposta osservata e Y max è normalizzata risposta di picco, [Ant] è il composto corrispondente A di concentramento, IC 50 è la concentrazione di antagonista che produce la metà-massimale inibizione della FFA-risposta evocata e n H è la collina apparente coefficiente. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: TRPA1 è un +-permeabile canale catione Ca 2, l'attivazione dei quali porta a afflusso di calcio che può essere rilevato dal Ca 2 +-sensitive colorante, Fluo-4 (1-2). Una linea cellulare HEK293-hTRPA1 stabile è stato utilizzato per studiare la concentrazione-risposta di TRPA1 agonisti e antagonisti. Le cellule sono state caricate con Fluo-4 AM, posto in 80 microlitri della tampone, e leggere con FlexStation 3. Dopo aver registrato la fluorescenza di base per 30 s, 40 ml di una diluizione di serie del agonista TRPA1, FFA, ciascuno a 3 volte la concentrazione finale desiderata, sono stati aggiunti alle cellule attraverso un multi-canale pipetter incluso come parte del modulo fluidica di FlexStation 3. I cambiamenti fluorescenza sono stati monitorati per ulteriori 180 s. Le variazioni relative Fluo-4 fluorescenza per ciascun pozzetto sono stati espressi come ΔF = (F - F 0), dove 0 F e F sono i valori di fluorescenza, al momento di interesse e l'inizio della lettura, rispettivamente. Tracce rappresentante dei corsi tempo ai cambiamenti fluorescenza in risposta ad una serie di concentrazioni di FFA sono mostrati in fig. 1. Nota per le ultime quattro concentrazioni di FFA, anche se i livelli di risposta massima sono simili, la cinetica di attivazione è chiaramente più veloce al superiore alle concentrazioni inferiori FFA. Pertanto, per distinguere queste differenze, la concentrazione - relazione dose-risposta è stato costruito misurando i tassi iniziali (pendenza) di aumento di fluorescenza dopo l'aggiunta di varie concentrazioni di FFA (Fig. 2). L'effetto mezzo massimoconcentrazione ive (CE 50) di FFA è stato determinato in 55,4 mM (n = 3). Per testare la putativo TRPA1 antagonista, composto A, abbiamo effettuato un esperimento simile con protocollo n. 2 (punto 2). In questo caso, una serie di diluizioni del antagonista sono stati aggiunti a 30 s (40 ml di 3x concentrazione finale desiderata) e il FFA è stato aggiunto dopo 180 s (60 microlitri a 300 mM per una concentrazione finale di 100 mM). Composto A dose-dipendente ridotto la risposta delle cellule TRPA1 di FFA con una mezza massima concentrazione inibente (IC 50) di 4,3 mM (n = 3) (Fig. 2). <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Concentrazione-dipendente l'attivazione di TRPA1 umani da parte di FFA. Le tracce sono aumentare FFA-evocato di fluorescenza nel tempo (risposta solo nei primi 60 s vengono mostrati per illustrare meglio la cinetica veloce del FFA-evocate risposte). Si informa che alle alte concentrazioni di FFA evocato aumento di fluorescenza con una cinetica molto più veloce rispetto a concentrazioni inferiori, anche se i livelli di picco di fluorescenza erano simili. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 Concentrazione -. Relazioni risposta per FFA cambiamento indotto fluorescenza e composto A indotta inibizione della risposta FFA umani TRPA1 stabilmente espressi in cellule HEK293. Δ, la concentrazione - relazione dose-risposta di FFA è stata determinata misurando il tasso iniziale (pendenza) di aumento di fluorescenza normalizzata dopo l'aggiunta di varie concentrazioni di FFA. O, concentrazione-risposta di inibizione della FFA-evocata risposta di calcio da un presunto TRPA1 antagonista, composto A.

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<li>Nanda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+of+adrenergic+receptors+by+measuring+intracellular+calcium+using+the+FlexStation+scanning+fluorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter.</a> Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Intracellulare di Ca 2 + gioca un ruolo importante in molte condizioni fisiologiche e patologiche, quali rilascio dei neurotrasmettitori (3), potenziale d&#39;azione cardiaco (4), la contrazione delle cellule muscolari (5), trasduzione del segnale cellulare (6-7), e la morte cellulare eccitotossico ( 8). Misura di Ca 2 + intracellulare livelli aiuta a chiarire cambiamenti funzionali di Ca 2 +-permeabile canali nella membrana plasmatica o organelli intracellulari e il contributo di ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> FlexStation 3 </td><td> Molecular Devices </td><td> FLEX3 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Beh, FlexStation Pipettare Consigli </td><td> Molecular Devices </td><td> 9000-0912 </td><td></td></tr><tr><td> Piastre a 96 pozzetti </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 655090 </td><td></td></tr><tr><td> 96-ben chiaro piastre a fondo piatto </td><td> Co-star </td><td> 3595 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12430-104 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-019 </td><td></td></tr><tr><td> Fluo, 04:00 </td><td> Invitrogen </td><td> F14202 </td><td></td></tr><tr><td> PluronicF-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-ornitina </td><td> Sigma </td><td> P36551 </td><td></td></tr><tr><td> probenecid </td><td> Sigma </td><td> P8761 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td></td></tr></tbody></table>

saggio basato su cellule di calcio per le medie e high throughput screening del prt funzioni canale utilizzando flexstation 3

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

FlexStation il Molecular Devices &#39;3 è un banco di lavoro multi-mode capaci di lettore per micropiastre automatico di misurazione della fluorescenza multi-pozzetti. E &#39;ideale per medie e high-throughput schermi in ambienti accademici. Ha un modulo integrato di trasferimento del liquido dotato di un multi-canale pipetter e la macchina legge una colonna alla volta per monitorare le variazioni di fluorescenza di una varietà di reagenti fluorescenti. Per esempio, FlexStation 3 è stato usato per studiare la funzione di Ca 2 +-permeabile canali ionici e G-proteine ​​recettori accoppiati misurando le variazioni di libero intracellulare di Ca 2 + livelli. Transitori recettore potenziale (TRP) i canali sono una grande famiglia di canali di comunicazione non selettivi che svolgono un ruolo importante in molte funzioni fisiologiche e fisiopatologiche. La maggior parte dei canali TRP sono il calcio permeabili e indurre influsso di calcio al momento dell&#39;attivazione. In questo video, dimostriamo l&#39;applicazione di FlexStation 3 a studiare il profilo farmacologico del canale TRPA1, un sensore molecolare per numerosi stimoli nocivi. Cellule HEK293 transitoriamente o stabilmente esprimere umano TRPA1 canali, coltivate in piastre a 96 pozzetti, vengono caricati con Ca 2 +-sensitive colorante fluorescente, Fluo-4, e le modifiche fluorescenza in tempo reale in queste cellule sono misurati prima e durante l&#39;applicazione di un agonista TRPA1 utilizzando la modalità FLEX del FlexStation 3. L&#39;effetto di un putativo TRPA1 antagonista stato anche esaminato. I dati vengono trasferiti dal software SoftMax Pro per la costruzione di concentrazione-risposta di TRPA1 attivatori e inibitori.

Questo video fornisce un protocollo dettagliato per lo studio del profilo farmacologico di umano TRPA1 canali utilizzando FlexStation 3. Il protocollo comprende dettagli di preparazione delle cellule, il caricamento colorante e il funzionamento del lettore per micropiastre, FlexStation 3.

Saggio basato su cellule di calcio per le medie e High Throughput Screening del PRT Funzioni canale utilizzando FlexStation 3

Il FlexStation 3 di Molecular Devices è un lettore di microplate multifunzione da banco in grado di eseguire misurazioni di fluorescenza automatizzate in piastre multiwell. È...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare l'applicazione del Flex Station Three per studiare il profilo farmacologico del canale del recettore potenziale transitorio, o TRPA1. Questo viene realizzato preparando innanzitutto cellule che esprimono canali TRPA1 in piastre microtitolazione da 96 pozzetti.Dopo aver lavato le cellule in un lavatore per micropiastre, le cellule vengono caricate con il colorante fluorescente sensibile al calcio. Flu oh 4:00 AM un periodo di caricamento cellulare è quindi seguito da diversi ulteriori lavaggi. Il passaggio successivo della procedura consiste nel preparare la piastra dei composti, inclusi un agonista trip a uno e un antagonista putativo trip a uno.Come passaggio finale, si configurano i parametri del software per la lettura della piastra nel sistema Flex Station three. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano relazioni dose-risposta per l'attivazione di trip A uno indotta dall'acido flu fonemico e l'inibizione da parte del composto antagonista A. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui meccanismi di attivazione del 21 mediante la misurazione dell'ingresso di calcio, può essere applicato anche allo st

cell-based-calcium-assay-for-medium-to-high-throughput-screening-trp

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Bioingegneria

Metodi per lo sviluppo e la convalida di un metodo quantitativo di fluorescenza per misurare l'attività di potassio raddrizzatore attivo (Kir) canali di screening ad alto rendimento composto è presentato.

High-throughput screening per la piccola molecola modulatori di canali di potassio Inward Rectifier

La basato sulla fluorescenza calcio saggio mobilitazione qui descritto è un sistema di screening inversa farmacologia media produttività per l'identificazione di ligando funzionalmente attivazione (s) di orfani accoppiato a proteina G recettori (GPCR).

Caratterizzazione di G recettori accoppiati alla proteina da un calcio di Mobilitazione Assay Basato sulla fluorescenza

Qui presentiamo tecniche per l'imaging di eventi locali di Ca2+ mediati da IP3 utilizzando la microscopia a fluorescenza in cellule di mammifero intatte caricate con indicatori di Ca2+ insieme a un algoritmo che automatizza l'identificazione e l'analisi di questi eventi.

Imaging locale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Segnali in cellule di mammifero coltivate

Presentiamo protocolli per l'applicazione del nostro indicatore di calcio (GECI) CatchER + per il monitoraggio dei rapidi transitori di calcio nel reticolo endoplasmatico / sarcoplasmatico (ER / SR) di HEK293 e delle cellule del muscolo scheletrico C2C12 utilizzando microscopia a fluorescenza in tempo reale. Viene inoltre discusso un protocollo per la misura e la calibrazione in K d in situ .

Monitoraggio del rilascio di Calcio di ER / SR con la Targeted Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensore CatchER<sup&gt; +</sup

Vengono descritte le tecniche per generare una libreria di peptidi corti in grado di attivare i mastociti tramite il recettore MRGPRX2. Le tecniche associate sono facili, poco costose e possono essere estese ad altri recettori cellulari.

Peptidi di screening che attivano MRGPRX2 utilizzando cellule HEK ingegnerizzate

Il presente protocollo descrive il controllo completamente ottico e l'osservazione dell'attività cellulare innescata nei cardiomiociti derivati da iPSC (iPSC-CM) per lo screening dei farmaci ad alto rendimento e i test di tossicità. Viene mostrata la quantificazione multiparametrica dei modelli fenotipici nel tempo e nello spazio. Vengono dimostrati gli effetti a lungo termine dei farmaci nell'arco delle ore o delle misurazioni sequenziali nei giorni.

Controllo ottico ad alta produttività e registrazione del segnale di calcio nei cardiomiociti derivati da iPSC per test di tossicità e screening fenotipico dei farmaci

Questo protocollo descrive un metodo per lo studio delle proteine di membrana elettrogeniche misurando le variazioni del potenziale di membrana. Questo test fornisce una piattaforma per la lettura funzionale di più canali ionici espressi endogenamente in linee cellulari epiteliali.

Un saggio basato sulla fluorescenza del potenziale di membrana per lo studio funzionale ad alta produttività di due canali ionici endogeni in due linee cellulari epiteliali

In questo lavoro, viene descritto un saggio di fluorescenza di calcio intracellulare ad alto rendimento per piastre a 384 pozzetti per lo screening di piccole librerie di molecole su recettori accoppiati a proteine G ricombinanti (GPCR). Il bersaglio, il recettore della chinina dalla zecca della febbre bovina, Rhipicephalus microplus, è espresso nelle cellule CHO-K1. Questo test identifica agonisti e antagonisti che utilizzano le stesse cellule in un test di "doppia addizione".

Un saggio di fluorescenza del calcio "a doppia aggiunta" per lo screening ad alta produttività dei recettori accoppiati a proteine G ricombinanti

Il targeting farmacologico dei canali ionici è un approccio promettente per il trattamento dei tumori solidi. Vengono forniti protocolli dettagliati per caratterizzare la funzione dei canali ionici nelle cellule tumorali e dosare gli effetti dei modulatori dei canali ionici sulla vitalità del cancro.

Screening dei canali ionici nelle cellule tumorali

È stato sviluppato un protocollo migliorato per un saggio di mobilizzazione del calcio con cellule endoteliali, utilizzato per identificare ligandi di recettori attivati dalla proteasi (PAR). Il nuovo protocollo riduce il tempo totale di analisi di 90-120 minuti e produce curve concentrazione-risposta riproducibili.

Caratterizzazione dei modulatori dei recettori attivati dalla proteasi con un saggio di mobilizzazione del calcio utilizzando un lettore di piastre

Questo articolo presenta un metodo per il monitoraggio quantitativo in tempo reale delle concentrazioni di ioni calcio (Ca2+) nelle cellule utilizzando l'imaging Ca2+ a singola cellula con il colorante Fura-2/AM. Questa tecnica consente un caricamento efficiente del colorante e un calcolo accurato dei livelli di Ca2+ attraverso i rapporti di intensità della fluorescenza, rendendola un approccio semplice e rapido per le applicazioni di ricerca.

Imaging del calcio a singola cellula per lo studio dell'attivazione dei canali ionici del calcio

Scopri il profilo farmacologico dei canali TRPA1 usando FlexStation 3 con saggi di calcio su cellule HEK 293. Questo metodo ad alto rendimento permette di studiare la modulazione dei canali ionici per applicazioni in farmacologia.

Saggio basato su cellule di calcio per le medie e High Throughput Screening del PRT Funzioni canale utilizzando FlexStation 3

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