Imaging ad alta risoluzione dei recettori dei neurotrasmettitori nelle sinapsi retiniche

Prendi una sezione retinica di topo su una griglia di microscopia elettronica. La sezione contiene cellule gangliari retiniche, o RGC, sinapticamente legate alle cellule bipolari. Le

cellule bipolari presinaptiche contengono vescicole di neurotrasmettitori disposte in una struttura a nastro vicino alla membrana sinaptica.

Le RGC postsinaptiche mostrano recettori di neurotrasmettitori raggruppati sulla loro membrana. Queste cellule sono marcate con la subunità B o CTB della tossina del colera.

Lavare con un tampone per mantenere il pH.

Incubare con un tampone di blocco per mascherare i siti di legame non specifici.

Incubare con anticorpi primari che hanno come bersaglio i recettori dei neurotrasmettitori e CTB.

Lavare con un tampone per rimuovere gli anticorpi non legati e mantenere il pH.

Incubare con anticorpi secondari coniugati a nanoparticelle d'oro di diverse dimensioni, che si legano agli anticorpi primari, marcando le molecole bersaglio.

Rimuovere gli anticorpi non legati, quindi asciugare il campione all'aria.

Applicare metalli pesanti che legano le macromolecole, migliorando il contrasto.

Utilizzando la microscopia elettronica, identificare le RGC utilizzando i CTB marcati e localizzare i recettori dei neurotrasmettitori marcati.

In questa fase, tagliare sezioni ultrasottili spesse 70 nanometri con un ultramicrotomo e raccoglierle sulle griglie di nichel rivestite di carbonio Formvar. Lavare le griglie in acqua distillata una volta, seguita da tre lavaggi di TBS. Quindi, incubare le griglie in 20 microlitri di BSA al 5% in TBS per 30 minuti, e poi in 20 microlitri di una miscela contenente anti-CTB di capra e un anticorpo contro una subunità NMDAR durante la notte a temperatura ambiente.

Dopodiché, lava le griglie tre volte con 20 microlitri di TBS ogni volta a pH 7.6. Successivamente, lavare una volta le griglie con TBS a pH 8,2 per cinque minuti. Incubare le griglie per due ore con 20 microlitri di una miscela contenente IgG anti-coniglio d'asino, accoppiate a particelle d'oro a 10 nanometri, e IgG anti-capra d'asino accoppiate a particelle d'oro a 18 nanometri.

Dopo due ore, lava le griglie in 20 microlitri di TBS a pH 7.6 tre volte, seguito da un lavaggio in acqua ultrapura. E poi asciugare all'aria le griglie. Successivamente, controcolorare le griglie con il 5% di acetato di uranile in acqua distillata per otto minuti, seguito da citrato di piombo allo 0,3% in acqua distillata per cinque minuti al buio.