JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:52 min. • April 28th, 2025
Inizia con una piastra multi-pozzetto contenente cellule di mammifero ricombinanti aderenti in una soluzione di stimolazione integrata con luciferina, un substrato luminescente.
Incuba per permettere l'ingresso della luciferina nella cella.
Queste cellule esprimono recettori odorosi legati alla membrana accoppiati con proteine G olfattive e proteine di trasporto dei recettori.
Inoltre, le cellule esprimono proteine citoplasmatiche Glosensor, proteine luminescenti sensibili all'AMP ciclico.
Aggiungere una soluzione odorizzante vaporizzabile nello spazio tra i pozzetti e posizionare la piastra all'interno di uno strumento luminometro pre-bilanciato con lo stesso odorizzante.
Inizia la misurazione della luminescenza.
Le molecole odorose si legano ai recettori odorosi delle cellule, attivando la proteina G accoppiata e dissociando la subunità α della proteina G, o Gα.
La subunità dissociata Gα si lega all'enzima adenilato ciclasi incorporato nella membrana, attivandolo. L'enzima attivato converte gli ATP in AMP ciclici.
Questi AMP ciclici si legano con le proteine glosensore, alterando la loro conformazione e abilitando il legame della luciferina.
Questa interazione produce luminescenza, confermando l'attivazione dei recettori degli odori.
Aggiungere 75 microlitri della soluzione reattiva cAMP. Rimuovere la soluzione di stimolazione dai pozzetti e aggiungere 25 microlitri di soluzione reattiva cAMP diluita a ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 96 pozzetti a temperatura ambiente in un ambiente buio e inodore per due ore.
Per prima cosa, diluire l'odorizzante acetofenone all'1% in 10 millilitri di olio minerale e tappare il tubo. Prima della fine del tempo di incubazione del reagente cAMP, aggiungere 25 microlitri di soluzione odorizzante a ciascun pozzetto in una nuova piastra da 96 pozzetti. Quindi posizionare questa piastra odorizzante nella camera del luminometro per cinque minuti per equilibrare la camera con molecole odorizzanti volatili. Impostare il luminometro per registrare la luminescenza con zero secondi di ritardo durante 20 cicli di misurazione della lastra di 90 secondi, con 0,7 secondi di intervallo tra i cicli.
Poco prima di leggere la piastra, rimuovere la piastra odorizzante dalla camera. Nella piastra a 96 pozzetti contenente le cellule trasfettate, aggiungere 25 microlitri di odorante nello spazio tra i pozzetti e rimettere rapidamente la piastra nella camera. Avviare la misurazione della luminescenza di tutti i pozzetti per 20 cicli entro 30 minuti.