Localizzazione a fluorescenza delle proteine a giunzione stretta e delle fibre di stress nelle cellule endoteliali

Prendi un vetrino a camera contenente una coltura monostrato di cellule endoteliali microvascolari cerebrali di ratto, o RBMEC, che imitano lo strato di cellule endoteliali della barriera emato-encefalica.

Le cellule presentano proteine di giunzione stretta e fibre di actina stressate a causa dello stress dovuto alla privazione di ossigeno-glucosio seguita dalla riossigenazione.

Rimuovi il terreno e lava le cellule, applica un fissativo per preservare l'architettura cellulare, poi lava via il fissativo in eccesso.

Trattare con un detergente per permeabilizzare le membrane cellulari.

Incubare con un agente bloccante per mascherare siti di legame non specifici.

Per marcare le proteine a giunzione stretta, incubare con anticorpi primari specifici, quindi rimuovere gli anticorpi non legati.

Incuba con anticorpi secondari coniugati con fluoroforo per marcare gli anticorpi primari.

In alternativa, per etichettare le fibre di stress, aggiungi falloidina marcata con fluoroforo.

Lava per rimuovere le molecole di etichettatura non legate.

Rimuovi la camera, applica un mezzo di montaggio contenente un colorante fluorescente legante il DNA per colorare i nuclei, quindi sigilla con un vetrino coprioggetti.

Utilizzando la microscopia confocale, visualizza le proteine della giunzione stretta marcate in modo fluorescente e le fibre di stress.

Iniziare con l'esposizione di ciascun pozzetto di monostrati RBMEC a 100-200 microlitri di terreno di sieroplastica ridotto Opti-MEM e continuare la loro incubazione per un'ora. Quindi lavare i vetrini della camera tre volte, utilizzando da 100 a 200 microlitri di PBS per pozzetto per lavaggio. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% in PBS e incubare i vetrini per 15 minuti a temperatura ambiente. E lavare via le celle tre volte con PBS come prima.

Ora, permeabilizzare le cellule applicando da 100 a 200 microlitri di Triton X-100 allo 0,5% in PBS in ciascun pozzetto. E lasciare incubare la piastra per altri 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo che le cellule sono state permeabilizzate, applicare la soluzione bloccante. E lasciare che questo agisca sulle celle per un'ora a temperatura ambiente.

Successivamente, eseguire l'immunofluorescenza per la proteina ZO-1 o etichettare la F-actina. Per condurre l'immunofluorescenza delle cellule per ZO-1, incubarle con l'anticorpo primario durante la notte a 4 gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare le cellule tre volte in PBS, ad esempio quando si rimuove il fissativo. Quindi incubare le cellule in 100-200 microlitri di anticorpo secondario anti-coniglio FITC tag per un'ora a temperatura ambiente, per marcare le cellule con falloidina rodamina.

Dopo aver applicato la soluzione bloccante per un'ora, esporre le cellule a 100-200 microlitri di rodamina falloidina in una diluizione da 1 a 50, con il 2% di BSA PBS per 20 minuti. Dopo l'incubazione dell'anticorpo secondario o della falloidina della rodamina, lavare nuovamente le cellule con PBS tre volte come prima. Quindi rimuovere le camere staccando l'elastico. Procedere con il montaggio delle diapositive, utilizzando un mezzo contenente antifade e DAPI. Visualizzare le cellule con la microscopia confocale su un unico piano con un obiettivo 60x.