Localizzazione a fluorescenza delle proteine a giunzione stretta e delle fibre di stress nelle cellule endoteliali

Prendi un vetrino a camera contenente una coltura monostrato di cellule endoteliali microvascolari cerebrali di ratto, o RBMEC, che imitano lo strato di cellule endoteliali della barriera emato-encefalica.

Le cellule presentano proteine di giunzione stretta e fibre di actina stressate a causa dello stress dovuto alla privazione di ossigeno-glucosio seguita dalla riossigenazione.

Rimuovi il terreno e lava le cellule, applica un fissativo per preservare l'architettura cellulare, poi lava via il fissativo in eccesso.

Trattare con un detergente per permeabilizzare le membrane cellulari.

Incubare con un agente bloccante per mascherare siti di legame non specifici.

Per marcare le proteine a giunzione stretta, incubare con anticorpi primari specifici, quindi rimuovere gli anticorpi non legati.

Incuba con anticorpi secondari coniugati con fluoroforo per marcare gli anticorpi primari.

In alternativa, per etichettare le fibre di stress, aggiungi falloidina marcata con fluoroforo.

Lava per rimuovere le molecole di etichettatura non legate.

Rimuovi la camera, applica un mezzo di montaggio contenente un colorante fluorescente legante il DNA per colorare i nuclei, quindi sigilla con un vetrino copriogge