Esecuzione di immunoistochimica su un tessuto cerebrale di primati non umani

Inizia con una sezione cerebrale di primati non umani fissata chimicamente.

Il fissativo a base di aldeidi lega le proteine, preservando la struttura dei tessuti, ma lascia alcuni residui di aldeidi reattive.

Lavare per rimuovere lo strato crioprotettivo che circonda la sezione di tessuto.

Aggiungere un agente riducente per neutralizzare i gruppi aldeidici reattivi, producendo sottoprodotti di reazione.

Lavare per rimuovere questi sottoprodotti e gli agenti riducenti in eccesso.

Applicare una soluzione bloccante per prevenire il legame non specifico degli anticorpi.

Aggiungere anticorpi primari mirati a una proteina espressa in siti specifici sulla membrana neuronale.

Lavare per rimuovere gli anticorpi non legati.

Aggiungere anticorpi secondari biotinilati mirati agli anticorpi primari.

Lavare per rimuovere gli anticorpi non legati.

Sovrapporre con complessi avidina-biotina-perossidasi che si legano agli anticorpi secondari.

Lavare nuovamente per rimuovere i complessi non legati.

Introdurre un substrato cromogenico insieme al perossido di idrogeno. In presenza di perossido di idrogeno, l'enzima perossidasi ossida il substrato, formando precipitati marroni.

Iniziare trasferendo sezioni spesse 50 micron di cervello di primate non umano fissato con acroleina, contenenti la regione di interesse in una piastra a 12 pozzetti contenente PBS. Lavare tre volte le sezioni flottanti in PBS per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi incubare le sezioni in una soluzione di boroidruro di sodio appena preparata per 30 minuti a temperatura ambiente. Oscilla dolcemente senza copertura.

Trascorsi i 30 minuti, aspirare il boroidruro di sodio e aggiungere PBS a ciascun pozzetto. Posizionare la piastra su un bilanciere e agitare energicamente per 10 minuti. Ripetere il lavaggio altre due volte o fino a quando non rimane più gas di reazione. Bloccare le sezioni incubando in una soluzione di siero normale al 2% e gelatina di pesce fredda allo 0,5%, diluita in PBS per un'ora a temperatura ambiente con un leggero oscillamento.

Una volta trascorso il tempo di incubazione, incubare le sezioni e la soluzione di anticorpi primari con un leggero dondolo per una notte a temperatura ambiente. Il giorno successivo, dopo aver lavato le sezioni come prima, incubare le sezioni in una soluzione di anticorpi secondari per 1,5 ore a temperatura ambiente con un leggero dondolio. Dopo aver lavato le sezioni come prima, incubare in avidina biotina perossidasi, o soluzione ABC, per un'ora con dondolo.

Successivamente, preparare una soluzione fresca di 3,3-diaminobenzidina allo 0,05% con perossido di idrogeno allo 0,005% diluito in TBS. Dopo il lavaggio, incubare le sezioni nella soluzione DAB per tre-sette minuti con un leggero dondolio. Una volta che il precipitato marrone si è sviluppato nel colore desiderato, interrompere la reazione lavando rapidamente due volte in TBS freddo, quindi attraverso una serie di lavaggi TBS e PB temporizzati.