JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:36 min. • April 28th, 2025
Prendi una diapositiva con sezioni incorporate in paraffina di neurosfere tumorali cerebrali, gruppi di cellule staminali neurali che esibiscono biomarcatori proteici nucleari specifici per il tumore.
Scalda per sciogliere la paraffina, rimuovila usando lo xilene e reidrata il tessuto usando concentrazioni di alcol decrescenti.
Riscalda in un tampone acido contenente detersivo per smascherare gli epitopi sui biomarcatori e permeabilizzare le membrane cellulari.
Risciacquare, quindi trattare con un agente ossidante per inattivare gli enzimi perossidasi endogeni, prevenendo segnali non specifici.
Applica una soluzione bloccante per mascherare siti di legame non specifici.
Incuba con anticorpi primari che prendono di mira gli epitopi dei biomarcatori.
Risciacquare, quindi trattare con anticorpi secondari coniugati con biotina che si legano agli anticorpi primari.
Risciacquare e incubare con un'avidina coniugata con l'enzima perossidasi, che si lega alla biotina.
Aggiungi un substrato cromogenico e un agente ossidante.
La perossidasi utilizza l'agente per convertire il substrato in precipitati colorati, etichettando la posizione del biomarcatore.
Controcolora i nuclei, disidrata il tessuto nell'alcol e monta il vetrino per l'imaging della distribuzione dei biomarcatori.
Per prima cosa, sciogliere la paraffina incubando i vetrini in una rastrelliera di metallo a 60 gradi Celsius per 20 minuti. Quindi deparaffinato i vetrini tramite incubazione in un treno di reidratazione a temperatura ambiente secondo il protocollo Tex. Conservare i vetrini in acqua di rubinetto per evitare il legame di anticorpi aspecifici. Successivamente, incubare i vetrini in tampone citrato a 125 gradi Celsius per 30 secondi a 90 gradi Celsius per 10 secondi. Lasciare raffreddare i vetrini prima di sciacquarli cinque volte con acqua distillata.
Successivamente, incubare i vetrini a temperatura ambiente in perossido di idrogeno allo 0,3% per 20 minuti. Quindi, lavare i vetrini per cinque minuti tre volte nel tampone di lavaggio con una leggera agitazione. Incubare i vetrini per una notte in una camera umidificata impostata a 4 gradi Celsius con anticorpo primario diluito. Successivamente, lavare i vetrini tre volte per cinque minuti con una leggera agitazione.
Successivamente, incubare i vetrini in un anticorpo secondario biotinilato diluito a temperatura ambiente per un'ora. Lavare i vetrini tre volte per cinque minuti nel tampone di lavaggio con una leggera agitazione. Quindi, incubare i vetrini nel complesso avidina biotinilato di perossidasi di rafano a temperatura ambiente al buio per un'ora. Ripetere il lavaggio come descritto in precedenza. Successivamente, incubare i vetrini con bande di substrato di perossido di idrogeno per due-cinque minuti a temperatura ambiente.
Sciacquare i vetrini con acqua di rubinetto e immergerli in una soluzione di ematossilina per contrastarli. Quindi sciacquare accuratamente gli scivoli in acqua di rubinetto fino a quando l'acqua non scorre limpida. Disidratare i vetrini secondo il protocollo Tex. Infine, applicare il vetrino coprioggetti con un mezzo di montaggio a base di xilene e lasciarli asciugare su una superficie piana a temperatura ambiente.