Imaging al microscopio elettronico a trasmissione dell'endocitosi della vescicola sinaptica nei neuroni dell'ippocampo di topo

Inizia trattando i neuroni dell'ippocampo di topo con un tampone ad alto contenuto di potassio contenente perossidasi di rafano o HRP.

L'alto potassio depolarizza i neuroni presinaptici, innescando l'esocitosi delle vescicole sinaptiche. I neuroni recuperano quindi le membrane delle vescicole sinaptiche attraverso l'endocitosi, incorporando HRP nelle vescicole appena formate. Fissare i neuroni con glutaraldeide e lavare per rimuovere la glutaraldeide in eccesso.

Aggiungi perossido di idrogeno e un substrato cromogenico, che viene ossidato da HRP per formare precipitati densi di elettroni. Lavare per rimuovere eventuali substrati non reagiti.

Trattare con tetrossido di osmio per migliorare il contrasto della membrana, quindi lavare via il reagente in eccesso. Quindi, aggiungi l'acetato di uranile per migliorare il contrasto degli organelli.

Disidrata i neuroni usando concentrazioni crescenti di etanolo e incorporali nella resina.

Identifica al microscopio le regioni ad alta densità cellulare e asportale. Quindi, prepara sezioni ultrasottili.

Trasferisci una sezione su una griglia di rame e contrastala con agenti di contrasto.

Utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione, le vescicole contenenti HRP appaiono come strutture dense di elettroni.

Stimolare la coltura del neurone ippocampale aggiungendo 1,5 millilitri di soluzione di stimolazione ad alto contenuto di potassio in ciascun pozzetto a temperatura ambiente per 90 secondi. In questa fase, preparare un tampone di cacodilato di sodio 0,1 molare a pH 7,4. Fissare le cellule con glutaraldeide al 4% in tampone di cacodilato di sodio 0,1 molare per almeno un'ora a temperatura ambiente.

Quindi, lavare le cellule tre volte con tampone di cacodilato di sodio 0,1 molare ogni volta per sette minuti. Successivamente, preparare la soluzione DAB e filtrarla con il filtro da 0,22 micrometri. Successivamente, applicare 1,5 millilitri di soluzione DAB sulle cellule per 30 minuti a 37 gradi Celsius.

Quindi, lavare le cellule tre volte con tampone di cacodilato di sodio 0,1 molare ogni volta per sette minuti. Come post-fissazione, incubare i neuroni con 1,5 millilitri di tetrossido di osmio all'1% in tampone di cacodilato di sodio molare 0,1 molare per un'ora a quattro gradi Celsius.

Successivamente, lavare i neuroni tre volte con 1,5 millilitri di tampone di cacodilato di sodio molare 0,1 ogni volta per sette minuti. Successivamente, preparare un tampone molare 0,1 molare di acetato di sodio con acetato di sodio e acido acetico glaciale. Lavare le cellule tre volte con 1,5 millilitri di tampone acetato molare 0,1 ogni volta per sette minuti.

Successivamente, incubare le cellule con 1,5 millilitri di acetato di uranile all'1% in tampone di acetato molare 0,1 molare per 1 ora a quattro gradi Celsius. Quindi, lavare le cellule tre volte con 1,5 millilitri di tampone acetato molare 0,1 per sette minuti ogni volta. In una cappa aspirante, disidratare la coltura neuronale con singoli lavaggi da 1,5 millilitri di etanolo al 50%, 70% e 90% per sette minuti ciascuno, seguiti da tre lavaggi con 1,5 millilitri di etanolo al 100% per sette minuti ogni volta.

Successivamente, creare la resina epossidica e mescolarla accuratamente e conservarla sotto vuoto per rimuovere le bolle d'aria. Infiltrarsi nel campione sostituendo l'etanolo con resina epossidica al 50% in etanolo su un agitatore per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi resina epossidica al 70% ed etanolo per 30 minuti a temperatura ambiente su un agitatore.

Cambiare la soluzione di resina epossidica con resina epossidica al 100% e incubare per 10 minuti a 50 gradi Celsius. Eseguire due sostituzioni di resina epossidica fresca al 100%. Ogni scambio viene incubato per un'ora a 50 gradi Celsius. Quindi, aggiungi resina epossidica fresca al 100% e lasciala indurire a 50 gradi Celsius durante la notte e poi a 60 gradi Celsius per oltre 36 ore.

Successivamente, rimuovere ogni campione dalla piastra a più pozzetti con la sega a mano del gioielliere. Utilizzando un microscopio a luce invertita, selezionare le regioni di interesse che hanno concentrazioni dense di cellule. Quindi, tagliare i blocchi di 4 x 5 x 8 millimetri cubici per il sezionamento. Successivamente, controcolorare le sezioni mediante immersione con acetato di uranile acquoso all'1% per 15 minuti e poi citrato di piombo acquoso al 3% per 5 minuti per migliorare il contrasto dei campioni.