Imaging al microscopio elettronico a trasmissione dell'endocitosi della vescicola sinaptica nei neuroni dell'ippocampo di topo

Inizia trattando i neuroni dell'ippocampo di topo con un tampone ad alto contenuto di potassio contenente perossidasi di rafano o HRP.

L'alto potassio depolarizza i neuroni presinaptici, innescando l'esocitosi delle vescicole sinaptiche. I neuroni recuperano quindi le membrane delle vescicole sinaptiche attraverso l'endocitosi, incorporando HRP nelle vescicole appena formate. Fissare i neuroni con glutaraldeide e lavare per rimuovere la glutaraldeide in eccesso.

Aggiungi perossido di idrogeno e un substrato cromogenico, che viene ossidato da HRP per formare precipitati densi di elettroni. Lavare per rimuovere eventuali substrati non reagiti.

Trattare con tetrossido di osmio per migliorare il contrasto della membrana, quindi lavare via il reagente in eccesso. Quindi, aggiungi l'acetato di uranile per migliorare il contrasto degli organelli.

Disidrata i neuroni usando concentrazioni crescenti di etanolo e incorporali nella resina.

Identifica al microscopio le regioni ad alta densità cellulare e asportale. Quindi, prepara sezioni ultrasottili.

Trasferisci una sezione su una griglia di rame e contrastala con agenti di contrasto.

Utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione, le vescic