Name: Estrazione di DNA virale da nucleocapsidi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Impara a isolare DNA virale ad alta purezza da nucleocapsidi di herpesvirus usando ultracentrifugazione ed estrazione con fenolo-cloroformio. Questo metodo consente sequenziamento ad alto rendimento e studi di biologia molecolare.

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Gli autori apprezzano i contributi di Greg Smith, Lisa Pomeranz, Matt Lyman, Marlies Eldridge, Halina Staniszewska Goraczniak, e membri del laboratorio Enquist nel perfezionare questo protocollo.

1. Primo Giorno: Infezione virale e preparazione del buffer <ol><li> Preparare piatti 50-10 (15 cm di diametro) di cellule di coltura per le infezioni, ad esempio, PK-15 cellule per virus pseudorabbia (PRV) o cellule Vero per l'herpes simplex virus (HSV). </li><li> Quando le cellule sono 95 - confluenti al 100%, li infettano a (MOI) di 5-10. Per fare questo, inoculare ciascuna piastra con magazzino virus in un volume totale di 4 ml per piastra, incubare le piastre per 1 ora a 37 ° C. Placche di roccia dolcemente ogni 15 minuti per assicurarsi che il monostrato cellulare rimane completamente rivestito con l'inoculo del virus. Nel frattempo, scaldare la media per il prossimo passo. </li><li> Dopo un'ora di infezione, aspirare l'inoculo virale dai piatti, aggiungere 15 ml di terreno caldo, e incubare a 37 ° C per 12-20 ore in un incubatore umidificato. </li><li> Preparare buffer LCM (vedi tabella 1) e rock notte a 4 ° C per omogeneizzazione della miscela. Preparare TNE per la risospensione del DNA virale (vedi Tabella 2). </li></ol> 2. Secondo giorno, Fase 1: la lisi cellulare e ultracentrifugazione <ol><li> Verificare visivamente che l'infezione di cellule ha causato uniforme effetto citopatico (CPE). Consentire l'infezione al progresso finché tutte le cellule hanno arrotondato per eccesso, ma non hanno sollevato il piatto. </li><li> Raschiare le cellule infettate nel mezzo, e combinano le cellule e mezzo in 50 ml provette coniche. Il numero di tubi conici necessarie per questo passo dipenderà dal numero di piatti usati per l'infezione nella fase 1.2, ad esempio, un tubo da 50 ml può essere utilizzato per far sedimentare un massimo di 3 piatti a base di 15 ml di mezzo di ogni opzione:. Sciacquare il piastre con 10 ml di PBS e si combinano con le cellule e medie imprese. </li><li> Cellule centrifuga e medie per 10 minuti a 2000 centifugal forza relativa (RCF) a temperatura ambiente, poi aspirare il surnatante e risospendere ogni pellet in 10 ml di PBS. Se il pellet da una infezione virale è stata diffusa in più tubi conici al punto 2.2, questi possono essere ricombinati in un tubo conico in questa fase. Ripetere centrifugazione e aspirazione. Optional: Questo pellet possono essere conservati a -20 ° C e il protocollo ha continuato in un secondo momento. </li></ol> 3. Secondo giorno, Fase 2: ultracentrifugazione Tenere il pellet di cellule e buffer LCM sul ghiaccio, quando possibile durante le fasi seguenti. <ol><li> Aggiungi β-mercaptoetanolo allo 0% glicerolo - buffer LCM. Iniziare il raffreddamento del ultracentrifuga (per il passo 3.9) impostandolo a 4 ° C e accendere il vuoto. </li><li> Risospendere il pellet in 5 ml di glicerolo 0% - buffer LCM fino a quando non è più disomogeneo. Se necessario, il tubo vortex per rompere ogni cellula indisciolto pellet. </li><li> Estrarre con l'aggiunta di 1,5 ml di Freon (1,1,2-tricloro-1 ,2,2-trifluoroetano) e vortex vigorosamente. Immediatamente centrifugare per 10 minuti a 2000 rcf ad una temperatura di 4 ° C. Raccogliere lo strato superiore con un ampio tunnel puntale (evitando l'interfaccia) e il trasferimento in una nuova provetta. Facoltativo: Se il pellet è un solido gelatinoso, si può rapidamente versare lo strato superiore in un nuovo tubo. </li><li> Ripetere l'estrazione Freon e centrifugare di nuovo. </li><li> Raccogliere lo strato superiore (~ 5 ml) e il trasferimento in una nuova provetta ultracentrifuga polyallomer. Aggiungi β-mercaptoetanolo per i restanti due glicerolo - buffer LCM. </li><li> Preparazione di un gradiente nella provetta da centrifuga polyallomer dal sottostante l'estratto Freon (strato superiore) con 3 ml di glicerolo al 5% - LCM (strato intermedio), sottostante e poi di nuovo con 2,5 ml di 45% glicerolo - LCM (strato inferiore). Utilizzare una pipetta sottile per evitare di overflow del contenuto della provetta. </li><li> Se necessario, preparare un tubo equivalente bilancia con le stesse proporzioni di buffer LCM. </li><li> Trasferimento tubi in secchi ultracentrifuga. Equilibrio secchi di 0,1 g di ogni altro, da dolci aggiungendo ulteriore glicerolo 0% - buffer LCM al livello superiore (~ 50-100 microlitri alla volta). </li><li> Utilizzando un ultracentrifuga freddo con un rotore orizzontale o oscillare, ruotare i campioni equilibrato per 1 ora a 77000 rcf (ad esempio 25.000 rpm per un rotore SW41Ti) ad una temperatura di 4 ° C. </li><li> Durante ultracentrifugazione, fare un gancio di vetro per catturare DNA galleggiante nel passaggio precipitazione in etanolo (4.6). Tenere entrambe le estremità di una pipetta Pasteur in vetro e sospendere la sezione centrale a fuoco. Quando una sezione del vetro è quasi fuso, tirare delicatamente per allungare il vetro, piegare delicatamente per creare un gancio ben angolato (&lt;90 gradi), e tirare bruscamente a sbarrare la strada alla fine. Se la punta del gancio vetro è aperto, tenere la punta sulla fiamma in modo che il vetro fonde a sufficienza per chiuderla. </li><li> Dopo l'ultracentrifugazione, si dovrebbe vedere un sottile opaca pellet con una macchia scura al centro. Con attenzione aspirare il liquido dal tubo, tra cui colature lungo i lati, ma evitando il pellet sul fondo della provetta. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di TNE a temperatura ambiente. </li><li> Lasciate che i pellet riposare per almeno 10 minuti per permettere l'idratazione del pellet. Optional: Il pellet può anche risospendere in TNE durante la notte, se conservato a 4 ° C. </li></ol> 4. Terzo Giorno: "Ghost" Precipitazione del DNA <ol><li> Spezzare il pellet pipettando con un piccolo foro puntale (ad esempio una punta p200 pipetta). Non preoccupatevi di taglio in questa fase, perché il DNA virale è ancora contenuto in capsidi a questo punto. Aggiungere i seguenti reagenti per il tubo contenente il virale a pellet, a temperatura ambiente, di distruggere capsidi: <ul><li> 4,25 ml TNE </li><li> 0,25 ml 10% SDS </li><li> 2 mg proteinasi K </li></ul> Agitare delicatamente per miscelare questi reagenti. Ci dovrebbe essere un leggero aumento della viscosità. </li></ol> Attenzione taglio da qui in poi, ad esempio l'uso di grosso calibro pipette e non vortice del materiale virale <ol start="2"><li> Estratto di proteine ​​virali con l'aggiunta di 5 ml di fenolo-cloroformio e iniziare immediatamente invertendo o vortex per mantenere una emulsione. Mescolare per 10 secondi, quindi l'emulsione centrifuga per 5 minuti a 2000 rcf a temperatura ambiente. Raccogliere il strato superiore con un ampio tunnel punta della pipetta, evitando l'interfaccia, e il trasferimento in una nuova provetta. Optional: Usa ad aggancio di fase gel (PLG), tubi in questa fase per evitare la contaminazione con l'interfaccia. </li><li> Ripetere l'estrazione fenolo-cloroformio e centrifugare di nuovo. </li><li> Dopo la seconda estrazione fenolo-cloroformio, raccogliere lo strato superiore in una provetta di vetro da 30 ml Corex e freddo il tubo a -20 ° C per 10-15 minuti, avendo cura che non congelare. </li><li> Aggiungere 10 ml di etanolo ghiacciato, coprire il tubo (ad esempio allungando un pezzo di Parafilm M sopra le righe), e miscelare immediatamente. Guardare per un DNA "fantasma" a comparire, che consiste in un precipitato ropy sottile. Capovolgere la provetta delicatamente per mescolare ulteriormente e provocare il DNA appiccicoso precipitati di raggruppare insieme. </li><li> Utilizzare un gancio di vetro per catturare il fantasma del DNA (s). Con attenzione macchia il DNA per eliminare il liquido in eccesso, quindi inserire il gancio (punta verso il basso) in una provetta da 1,5 ml e lasciare asciugare. Aggiungi 0,25-0,5 ml di TE per sciogliere il fantasma del DNA. Lasciare risospensione del DNA per procedere per almeno un'ora. DNA conservare a 4 ° C. Facoltativo: per massimizzare la resa del DNA, rompere il gancio di vetro nella provetta da 1,5 ml, in modo che la risospensione fuori i frammenti di vetro possa continuare nel tempo. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Con un sufficientemente elevato MOI, le cellule devono raggiungere la piena CPE entro ~ 18 ore dopo l'infezione (HPI) per i ceppi wild-type PRV, e ~ 24 HPI di wild-type ceppi di HSV-1 (Figura 1). Una volta infettato il pellet cellulare viene raccolta, i passaggi rimanenti protocollo può essere completa in un solo giorno o svolte nell'arco di due giorni (Figura 2). Quando si prepara ganci di vetro per catturare il fantasma del DNA, è importante per rendere l'angolo gancio essere inferiore a 90 gradi, in modo che poi si può andare bene nella base di un tubo da 1,5 ml (Figura 3). Sigillando la punta di questo gancio previene la perdita di DNA all'interno della pipetta. Fantasmi del DNA si formano durante la fase di precipitazione e appariranno come bianco, fili filante (Figura 4). Questi aggregati e bastone tra loro e / o il gancio di vetro utilizzato per catturare il DNA. Così il gancio stesso bicchiere può essere usato per raccogliere più thread di DNA all'interno della soluzione di precipitazione. <table border="1"><tbody><tr><td> Scegli colonna in base al volume desiderato: </td><td> 10 ml </td><td> 15 ml </td><td> 20 ml </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td> 1M KCL </td><td> 1,3 ml </td><td> 1,9 ml </td><td> 2,5 ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1M Tris (pH 7,4) </td><td> 300 ul </td><td> 450 microlitri </td><td> 600 microlitri </td><td> 1,2 ml </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 50 microlitri </td><td> 75 microlitri </td><td> 100 ul </td><td> 200 l </td></tr><tr><td> 0,5 EDTA </td><td> 10 microlitri </td><td> 15 microlitri </td><td> 20 l </td><td> 40 microlitri </td></tr><tr><td> NP40/IGEPAL </td><td> 50 microlitri </td><td> 75 microlitri </td><td> 100 ul </td><td> 200 l </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanolo (aggiungere immediatamente prima dell'uso) </td><td> 4,3 microlitri </td><td> 6,5 microlitri </td><td> 8,6 microlitri </td><td> 17,2 microlitri </td></tr><tr><td colspan="5"></td></tr><tr><td colspan="5"> Utilizzare le proporzioni per cento glicerolo desiderato (0, 5 o 45%) </td></tr><tr><td> 0% glicerolo </td><td> Nessuno </td><td> Nessuno </td><td> Nessuno </td><td> Nessuno </td></tr><tr><td> acqua </td><td> 8,3 ml </td><td> 12,5 ml </td><td> 16,7 ml </td><td> 33,4 ml </td></tr><tr><td> 5% di glicerolo </td><td> 0,5 ml </td><td> 0,8 ml </td><td> 1,0 ml </td><td> 2,0 ml </td></tr><tr><td> acqua </td><td> 7,8 ml </td><td> 11,7 ml </td><td> 15,7 ml </td><td> 31,4 ml </td></tr><tr><td> 45% glycerol </td><td> 4,5 ml </td><td> 6,8 ml </td><td> 9,0 ml </td><td> 18,0 ml </td></tr><tr><td> acqua </td><td> 3,8 ml </td><td> 5,7 ml </td><td> 7,7 ml </td><td> 15,4 ml </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Ricette per la preparazione di tamponi LCM <table border="1"><tbody><tr><td> Per 50 ml </td></tr><tr><td> 5 ml 1M NaCl </td></tr><tr><td> 2,5 ml 1M Tris, pH 7,5 </td></tr><tr><td> 1 ml di EDTA 0,5 </td></tr><tr><td> 41,5 ml di H 2 O </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Preparazione di TNE (0,1 M di NaCl, 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM EDTA) <table border="1"><tbody><tr><td> Per 1 volume L </td></tr><tr><td> 0,2 g KCl </td></tr><tr><td> 0,2 g di KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 8 g di NaCl </td></tr><tr><td> 1.15g Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> H 2 O per 1L </td></tr></tbody></table> Tabella 3. Preparazione del PBS (2,7 mM KCl, 1.5 mM KH 2 PO 4; 137 mm NaCl; 8,1 mM Na 2 HPO 4, pH 7,0) <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. PK15 cellule (A) prima infezione, (B) a metà strada attraverso l'infezione, e (C) a effetto citopatico (CPE), dopo una molteplicità di infezione. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Panoramica del protocollo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Tre esempi rappresentativi di vetro ami utilizzati per raccogliere i fantasmi del DNA virale. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Esempio rappresentativo di una ben formata e abbondante DNA "fantasma".

<ol><li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li>
<li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins%3A+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li>
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<li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li>
<li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus%2C+an+alphaherpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+virology%22">Principles of virology</a>. , 3rd edn, ASM Press. (2008).</li>
<li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pseudorabies+virus%3A+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li>
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<li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li>
<li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li>
<li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Parti di questo protocollo sono stati originariamente sviluppati per l&#39;isolamento del DNA virale nel BSL4 condizioni, ma si adatta altrettanto bene a non BSL condizioni. 4 Si comunemente utilizzano questo protocollo per isolare il DNA dalla alfa-herpesvirus PRV e HSV-1, che hanno genomi di DNA racchiuso in una capside proteica e circondato da un involucro lipidico. 7,8 Tuttavia è probabile direttamente adattabile ad altri virus a DNA di grandi dimensioni, tra cui beta-e gamma-herpes virus e gli...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Freon (1,1,2-tricloro-1 ,2,2-trifluoroetano) </td><td> Pescatore </td><td> T178-4 </td><td> Chiedi al tuo istituto per le linee guida sullo smaltimento appropriato dei rifiuti contenenti freon, o vedere Mendez et al. alternative Freon potenziale 9. </td></tr><tr><td> Fase di bloccaggio tubi di gel, Heavy capacità di 15 ml </td><td> 5 PRIME </td><td> 2302850 </td><td> Opzionale </td></tr><tr><td> Polyallomer ultracentrifuga tubi </td><td> Beckman * </td><td> 331372 * </td><td> * Tubi Seleziona appropriato per il proprio ultracentrifuga; questi sono inclusi come esempio solo </td></tr><tr><td> NP-40 / IGEPAL </td><td> Sigma </td><td> I-3021 </td><td></td></tr><tr><td> PK-15 cellule </td><td> ATCC </td><td> CCL-33 </td><td></td></tr><tr><td> Cellule Vero </td><td> ATCC </td><td> CCL-81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

estrazione di dna virale da nucleocapsidi

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

I virus sono parassiti obbligati cellulare, e quindi lo studio del loro DNA virale richiede materiale isolante lontano da agenti inquinanti e del DNA della cellula ospite. Diverse applicazioni a valle richiedono grandi quantità di puro DNA virale, che viene fornito da questo protocollo. Queste applicazioni includono il sequenziamento del genoma virale, in cui la rimozione del DNA ospite è fondamentale per ottimizzare l&#39;output dei dati per le sequenze virali, e la produzione di nuovi ceppi virali ricombinanti, in cui la co-trasfezione del plasmide purificato e lineare facilita la ricombinazione del DNA virale. 1,2, 3 Questa procedura utilizza una combinazione di estrazioni e la densità a base di centrifugazione per isolare il DNA purificato lineare herpesvirus nucleocapside dalle cellule infette. 4,5 Le fasi iniziali di purificazione scopo di isolare purificata capsidi virale, che contengono e proteggono il DNA virale durante le estrazioni e le fasi di centrifugazione che rimuovono le proteine ​​cellulari e il DNA. Lisi delle nucleocapsidi quindi rilascia DNA virale, e due finali fenolo-cloroformio passi rimuovere le proteine ​​rimanenti. Il DNA finale catturato da una soluzione è altamente concentrato e puro, con un valore medio di 1,90 260/280. A seconda della quantità di cellule infette utilizzati, i rendimenti della gamma DNA virale 150-800 mg o più. La purezza di questo DNA rende stabile durante conservazione a lungo termine a 4C. Questo DNA è quindi ideale per high-throughput sequencing, l&#39;alta fedeltà reazioni di PCR, e trasfezioni. Prima di iniziare la procedura, è importante conoscere il numero medio di cellule per piatto (ad esempio una media di 8 x 10 6 PK-15 cellule in un piatto confluenti 15 cm), e il titolo dello stock virale da utilizzare ( ad esempio, 1 x 10 8 unità formanti placca per ml). Queste sono necessarie per calcolare la molteplicità appropriata di infezione (MOI) per il protocollo. 6 Per esempio, per infettare piatto da 15 cm di PK-15 celle con il brodo sopra virale, ad una MOI di 5, si usa 400 ml di magazzino virale e diluire con 3,6 ml di terreno (volume inoculazione totale di 4 ml per piastra da 15 cm). Molteplici preparazioni di DNA virale può essere preparato allo stesso tempo. Il numero di preparati simultanea è limitata solo dal numero di tubi detenuta dal rotore ultracentrifuga (uno per ogni virus; vedi punto 3.9). Qui si descrive la procedura come se venisse fatto per un virus.

Noi descriviamo il processo di isolamento del DNA ad alta herpesvirus nucleocapside purezza dalle cellule infette. Il DNA finale catturato dalla soluzione è di alta concentrazione e purezza, rendendolo ideale per high-throughput sequencing, l&#39;alta fedeltà reazioni di PCR, e trasfezioni per produrre nuovi ricombinanti virali.

Estrazione di DNA virale da nucleocapsidi

I virus sono parassiti cellulari obbligati e, pertanto, lo studio del loro DNA richiede l'isolamento del materiale virale dai contaminanti e dal DNA della cellula ospite. ...

In questo video viene illustrata una procedura per isolare nucleocapsidi virali e DNA ad alta purezza da cellule infette. Innanzitutto, le membrane lipidiche vengono denaturate mediante un'estrazione doppia senza fenolo. Il campione viene quindi sottoposto a ultracentrifugazione per formare un pellet di nucleocapsidi virali e separarli dalle componenti cellulari e virali più leggere.Viene aggiunto detergente e proteasi K per liberare il DNA virale dai nucleocapsidi pellettizzati. Successivamente, vengono effettuate due estrazioni con fenolo-cloroformio per rimuovere tutte le proteine rimanenti. Infine, il DNA virale viene precipitato in soluzione.In definitiva, i risultati mostrano che il DNA virale altamente concentrato e puro è stato isolato da queste cellule infette. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, che non prevedono estrazioni libere da reagenti o ultracentrifugazione, è che il DNA virale ottenuto presenta livelli molto bassi di contaminazione da DNA dell'ospite, rendendolo ideale per procedure successive come la PCR e il sequenziamento approfondito dei genomi virali. Abbiamo utilizzato per la prima volta questo metodo nei primi tempi dei lavori sul DNA ricombinante, quando misure precauzionali aggiuntive rivestivano un'importanza fondamentale.Abbiamo sviluppato questa procedura per isolare il DNA virale lavorando all'interno di una cappa a condizioni BSL-4. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la formazione del gradiente e i passaggi di precipitazione del DNA (ghosting) sono difficili da apprendere. Ciò avviene perché l'applicazione a strati del gradiente richiede una mano estremamente ferma e la precipitazione del DNA in soluzione può essere difficile da individuare se non si ha esperienza pregressa nell'identificarla.Iniziare questa procedura preparando cinque o dieci piastre di diametro pari a 15 centimetri contenenti cellule in coltura tessutale da infettare. In questo caso, le cellule PK 15 vengono preparate per l'infezione con il virus della pseudorabbia quando raggiungono una confluenza del 95-100%. Sostituire quindi il mezzo di coltura con quattro millilitri di mezzo contenente il virus. Incubare le piastre per un'ora in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius e 5% CO2, agitando ogni 15 minuti.Agitare delicatamente le piastre per assicurare che il monostrato cellulare rimanga completamente ricoperto dall'inoculo virale. Durante l'incubazione, riscaldare il mezzo per il passaggio successivo. Dopo un'ora di infezione, aspirare l'inoculo virale dalle piastre.Quindi aggiungere 15 millilitri di mezzo tiepido e incubare a 37 gradi Celsius per 12-20 ore in un incubatore umidificato. Infine, in preparazione per gli esperimenti del giorno successivo, preparare un nuovo lotto di tamponi LCM e TNE. Si noti che l'aggiunta di NP 40 provocherà la formazione di nastri nella soluzione acquis.Collocare le soluzioni preparate su un agitatore rotativo a quattro gradi Celsius durante la notte. Entro il giorno successivo, le soluzioni dovrebbero essere completamente integrate. Collocare la piastra sul piano di un microscopio composto e verificare visivamente che l'infezione delle cellule abbia provocato un effetto citopatico uniforme.Tutte le cellule dovrebbero essere arrotondate, ma non dovrebbero essersi staccate dalla piastra. Se le cellule non si sono ancora arrotondate, proseguire l'incubazione fino a quando non vengono osservati effetti citopatici. Successivamente, raschiare le cellule infette nel mezzo e raccogliere le cellule nel mezzo in provette coniche da 50 millilitri per aumentare il rendimento.Lavare le piastre con 10 millilitri di PBS e combinare con le cellule nel mezzo, quindi centrifugare le cellule e il mezzo per 10 minuti a 2000 RCF a temperatura ambiente per eliminare il mezzo e il siero residui; aspirare il soprannatante e risospendere il pellet in 10 millilitri di PBS. Ripetere la centrifugazione e l'aspirazione. Se l'esperimento non dovrà essere proseguito nello stesso giorno, conservare il pellet a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo nei passaggi illustrati in questa sezione.È importante mantenere il pellet cellulare e i tamponi LCM sul ghiaccio ogni volta che possibile. Prepararsi per l'ultrafiltrazione aggiungendo etanolo Beamer capto al tampone LCM con glicerolo 0% in modo che la concentrazione finale di etanolo Beamer capto sia dello 0,043%. Preparare anche l'ultracentrifuga impostandola a quattro gradi Celsius e attivando il vuoto mentre l'ultracentrifuga si raffredda. Aggiungere cinque millilitri di tampone LCM con glicerolo 0% contenente lo 0,043% di etanolo Beamer capto al pellet cellulare e pipettare su e giù per risospendere il pellet.Assicurarsi di disperdere tutti i grumi, se necessario. Vortexare il tubo per disperdere qualsiasi pellet di cellule non disciolto. Successivamente, per estrarre le membrane cellulari e virali, aggiungere 1,5 millilitri.Agitare vigorosamente il freon in un vortice immediatamente. Centrifugare per 10 minuti a 2000 RCF a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, si formeranno due strati.Lo strato acquoso superiore contiene nucleo virale, capside e proteine, mentre lo strato inferiore di Freon contiene membrane virali e cellulari. Utilizzando una punta pipetta a largo diametro, raccogliere lo strato superiore evitando l'interfaccia e trasferirlo in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. È fondamentale evitare di toccare lo strato di Freon e di trasferire tale solvente organico nello strato acquoso nel nuovo tubo.Aggiungere freon e vortexare come in precedenza per ripetere l'estrazione con Freon dopo la centrifugazione. Raccogliere lo strato superiore, circa cinque millilitri, e trasferirlo in un nuovo tubo da ultracentrifuga in poliammide. Aggiungere etanolo beamr capto allo 0,043% ai due tamponi LCM con glicerolo rimanenti.Successivamente, per preparare un gradiente nel tubo centrifuga in polimero, utilizzare una pipetta sottile per sovrapporre al fondo l'estratto di Freon con tre millilitri di LCM al 5% di glicerolo. Quindi, sovrapporre sotto questo 2,5 millilitri di LCM al 45% di glicerolo. Inoltre, se necessario, preparare un tubo di bilanciamento equivalente utilizzando le stesse proporzioni di tamponi LCM.Posizionare i tubi nei becher della ultracentrifuga e bilanciarli entro 0,1 grammi l'uno dall'altro aggiungendo delicatamente, in porzioni da 50 a 100 microlitri, ulteriore tampone LCM con glicerolo 0% nello strato superiore. Centrifugare i campioni bilanciati per un'ora a 77.000 RCF a quattro gradi Celsius durante l'ultracentrifugazione. Utilizzare una pipetta Pasteur di vetro per creare un gancio atto a catturare il DNA galleggiante nella fase di precipitazione con etanolo.Tenere entrambe le estremità della pipetta e sospendere la sezione centrale sopra una fiamma. Quando una sezione del vetro è calda, tirare delicatamente per allungare il vetro. Piegarla dolcemente per creare un gancio con un angolo stretto inferiore a 90 gradi e tirare bruscamente per sigillare l'estremità.Se la punta del gancio di vetro è aperta, tenere la punta sopra le fiamme in modo che il vetro si fonda a sufficienza da chiuderla. Dopo l'ultracentrifugazione, si formerà un pellet sottile e opaco con una macchia scura al centro, che contiene il nucleo virale. Aspirare con attenzione il liquido dal tubo, comprese le goccioline lungo i lati, evitando il pellet sul fondo del tubo.Aggiungere 0,5 millilitri di TNE a temperatura ambiente. Lasciare in posa il pellet per almeno 10 minuti per consentire l'idratazione. Se la procedura non verrà proseguita il giorno successivo, collocare il pellet risospeso a quattro gradi Celsius.Utilizzando una punta P 200, frammentare il pellet idratato aspirando e dispensando più volte. Non preoccuparsi della rottura in questa fase poiché il DNA virale è ancora contenuto nei capside. Per rompere i capside, aggiungere al pellet virale 4,25 millilitri di TNE, 0,25 millilitri di SDS al 10% e due milligrammi di proteina EK a temperatura ambiente.Agitare delicatamente per mescolare questi reagenti. Dovrebbe verificarsi un leggero aumento della viscosità ora che i capside sono stati distrutti; prestare attenzione per evitare la frammentazione del DNA utilizzando pipette con punte larghe e non vortexare il materiale virale per estrarre le proteine virali.Trasferire il campione in una provetta con gel per blocco della fase e aggiungere cinque millilitri di fenolo-cloroformio. Iniziare immediatamente a capovolgere ripetutamente la provetta per mantenere un'emulsione omogenea, effettuando almeno 10 secondi di inversioni. Centrifugare quindi l'emulsione per cinque minuti a 2000 RCF a temperatura ambiente.Dopo la centrifugazione, prelevare il livello superiore e trasferirlo in un nuovo tubo con gel di blocco di fase. Ripetere l'estrazione con fenolo cloroformio e centrifugare nuovamente dopo la seconda estrazione con fenolo cloroformio. Raccogliere il livello superiore in un tubo coex di vetro da 30 millilitri e raffreddare il tubo a meno 20 gradi Celsius per 10-15 minuti.Avendo cura che non geli. Aggiungere 10 millilitri di etanolo freddo dal dispositivo. Chiudere il tubo con un film e capovolgerlo per mescolare.Osservare immediatamente l'eventuale formazione di un "fantasma di DNA", costituito da un precipitato sottile e filamentoso. Invertire delicatamente il tubo per mescolare ulteriormente e favorire l'aggregazione dei precipitati di DNA appiccicosi. Infine, utilizzare un uncino di vetro per recuperare con attenzione i fantasmi di DNA e asciugarli tamponandoli con un fazzoletto assorbente per rimuovere il liquido in eccesso.Quindi posizionare la punta del gancio verso il basso in una provetta da 1,5 millilitri. Per massimizzare il rendimento di DNA, spezzare il gancio di vetro all'interno della provetta da 1,5 millilitri in modo che la sospensione di resuspensione dai frammenti di vetro possa continuare nel tempo. Lasciare asciugare e aggiungere da 0,25 a 0,5 millilitri di TE per sciogliere il "ghost" di DNA.Lasciare procedere la risospensione del DNA per almeno un'ora e conservare il DNA a quattro gradi Celsius. Il DNA virale è stato preparato da nucleocapsidi come descritto in questo articolo video; qui è mostrato un esempio rappresentativo di un "ghost" di DNA ben formato e abbondante, costituito da DNA genomico virale lineare precipitato in soluzione. I filamenti si aggregano tra loro e richiederanno tempo per riidratarsi una volta posti in una soluzione acquosa. Il DNA virale preparato da ceppi di PRV, Becker Bartha e altri quattro ceppi aggiuntivi è stato sottoposto ad elettroforesi per un'ora su un gel di agarosio allo 0,5% e colorato con bromuro di etidio.Ogni campione di PRV utilizza un microlitro di una preparazione di nucleocapside di DNA virale in un volume totale di 250 microlitri sulla sinistra. Una scala ottenuta con fago batterico lambda. La digestione del DNA sty uno dimostra le grandi dimensioni del DNA di lambda non digerito, pari a 48,5 paia di chilobasi, e del DNA genomico di PRV, approssimativamente 140 paia di chilobasi.Successivamente, una serie di diluizioni di quantità note di DNA Lambda dimostra che la concentrazione dei campioni di PRV a destra varia da 50 a 200 nanogrammi per microlitro, per un rendimento totale di 12 a 50 microgrammi per virus. I campioni di DNA virale, preparati da quattro ceppi di PRV, sono stati digeriti per tutta la notte con BAM H uno o KPN uno. I campioni di DNA digeriti con enzimi di restrizione sono stati separati mediante elettroforesi notturna su un gel di agarosio allo 0,8% e colorati con bromuro di athe.Le corsie H una includono otto microgrammi di nucleocapside virale, DNA, mentre le corsie KPN una includono quattro microgrammi di DNA virale. Ogni ceppo diverso di PRV può essere distinto in base ai rispettivi modelli di polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione. Seguendo questa procedura, altri metodi come il sequenziamento profondo possono essere eseguiti al fine di ottenere dati sul contenuto del genoma virale dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della virologia per caratterizzare il DNA virale mediante polimorfismi della lunghezza dei frammenti di restrizione, o R fps, ibridazione Southern, clonazione, costruzione di virus DNA ricombinanti e altre manipolazioni di virus erpetici e di altri tipi di virus.Non dimenticare che lavorare con fon può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come l'operare in una cappa aspirante devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura. Dopo la centrifugazione, lo strato di fon può passare rapidamente da una consistenza semisolida gelatinosa a uno stato liquido, quindi ogni provetta deve essere valutata singolarmente prima di decidere se versare o pipettare rappresenti il metodo migliore per raccogliere lo strato superiore acquoso.

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