Marcatura retrograda dei motoneuroni di Drosophila utilizzando coloranti lipofili fluorescenti

Inizia con un embrione di Drosophila sezionato fissato su un vetrino con del nastro adesivo intorno.

I motoneuroni della mosca sono etichettati in modo fluorescente per la visualizzazione.

Utilizzando un microscopio, visualizza l'embrione e posiziona una micropipetta fluorescente verde riempita di colorante lipofilo vicino all'embrione.

Quindi, passa alla modalità di fluorescenza e individua la punta assonale del motoneurone alla giunzione neuromuscolare, dove il motoneurone si collega al muscolo.

Passa alla modalità campo chiaro, contatta la punta dell'assone bersaglio con la pipetta, rilascia una goccia di colorante e poi incuba.

A causa della loro natura lipofila e della vicinanza assonale, i coloranti entrano selettivamente nella membrana ricca di lipidi dell'assone bersaglio.

Nel corso del tempo, il colorante viaggia retrogradamente, muovendosi all'indietro lungo il doppio strato lipidico assonale verso il corpo neuronale, etichettando le proiezioni neuronali.

Rimuovi il nastro adesivo dalla diapositiva e posiziona un vetrino coprioggetti.

Osserva il vetrino sotto un microscopio confocale.

Il neurone bersaglio marcato retrogrado appare in fluorescenza verde, mostrando una morfologia neuronale dettagliata e proiezioni.

Utilizzare un ago di vetro al microscopio da dissezione per trascinare l'embrione fuori dalla membrana vitellina dal nastro sul vetro, facendo attenzione a non danneggiare i tessuti interni dell'embrione. Quindi tagliare la linea mediana di un singolo embrione sulla sua superficie dalla sua estremità posteriore a quella anteriore. Capovolgere i tessuti epiteliali dal centro e attaccare il bordo epidermico sulla superficie del vetrino.

Utilizzare un ago collegato a un tubo con l'apertura della punta di circa 300 micrometri per aspirare o soffiare aria per rimuovere i tronchi tracheali longitudinali dorsali, nonché eventuali budella rimanenti. Utilizzare il 4% di PFA e PBS per fissare gli embrioni per 5 minuti a temperatura ambiente su uno shaker orbitale. Quindi lavali tre volte con PBS.

Colorare gli embrioni con 1 microlitro di anticorpo anti-perossidasi di rafano coniugato con colorante cianina 3 e 200 microlitri di PBS per un'ora sull'agitatore orbitale. E ripeti i lavaggi in PBS. Per riempire la micropipetta per iniezione, inserirla nel supporto capillare. Quindi, posizionare il vetrino di colorante sul tavolino e utilizzare il micromanipolatore per posizionarlo sopra il vetrino.

Quindi regolare il tavolino per posizionare la micropipetta sul colorante. Raccogliere il colorante e la micropipetta impostando la pressione di iniezione tra 200 e 500 ettopascal, il tempo di iniezione tra 0,1 e 0,5 secondi e la pressione di compensazione su 0 per 5 minuti. Una volta raccolto il colorante, rimuovere il vetrino e posizionare il campione sul tavolino del microscopio.

Quindi aumentare la pressione di compensazione a un intervallo compreso tra 30 e 60 ettopascal e abbassare la micropipetta nel campione. Utilizzare l'obiettivo 10 volte per localizzare l'embrione e allineare la micropipetta con l'embrione. Sostituire l'obiettivo con un obiettivo a immersione in acqua 40 volte e immergere l'obiettivo nel PBS.

Utilizzare la microscopia a fluorescenza per controllare la morfologia neuronale contrassegnata da anti-HRP Cy3 e determinare il sito di iniezione. Quando l'embrione è a fuoco, modificare la posizione della micropipetta per stabilire un contatto delicato con la punta dell'assone di interesse. Quindi utilizzare la microscopia a campo chiaro durante l'iniezione per vedere la gocciolina di colorante. Far cadere il colorante in un emisegmento addominale destro alla giunzione neuromuscolare di ACC o RP3 con DiD o DiO.

Utilizzare la pulsantiera per rilasciare il colorante e rimuovere la micropipetta. Quindi passare al sito di iniezione successivo. Incubare il campione per 1 ora a temperatura ambiente su un agitatore orbitale prima dell'imaging. Utilizzando una pinza fine, rimuovere i nastri dal vetrino.

Per montare il campione, preparare un vetrino coprioggetti con una piccola quantità di grasso sottovuoto ai quattro angoli. Posizionarlo con cura sul campione, assicurandosi di evitare bolle d'aria. Spingere verso il basso il vetrino coprioggetti per regolare lo spazio dal campione in modo da consentire la distanza di lavoro tra la lente dell'obiettivo e il vetrino.

Rimuovi il PBS in eccesso con le salviette delle attività. Sigillare completamente i bordi del vetrino coprioggetti con lo smalto. Immagine con ingrandimento 10x e 100x con un microscopio confocale ed elaborazione delle immagini con il software ImageJ.