Imaging del traffico proteico GLUT4 nei neuroni ipotalamici primari di topo mediante microscopia a deconvoluzione

Inizia con neuroni ipotalamici primari di topo wild-type e CCR5-knockout coltivati su vetrini coprioggetti rivestiti di poli-D-lisina in una piastra multi-pozzetto.

Questi neuroni esprimono il trasportatore di glucosio-4 (GFP-GLUT4) marcato con una proteina fluorescente verde (GFP-GLUT4) nel citoplasma.

Trasferisci i vetrini coprioggetti su vetrini e rimuovi delicatamente il terreno in eccesso per garantire stabilità durante l'acquisizione dell'immagine.

Posiziona un vetrino sul tavolino del microscopio di deconvoluzione con il vetrino coprioggetti rivolto verso il basso.

Visualizza i neuroni sotto l'illuminazione a campo chiaro, quindi trattali con la chemochina CCL5 e l'insulina in sequenza.

Passa all'illuminazione a fluorescenza per identificare i neuroni bersaglio che esprimono GFP-GLUT4 e regola i parametri di imaging per catturare immagini fluorescenti dal vivo.

Nei neuroni wild-type, insulina e CCL5 si legano rispettivamente al recettore dell'insulina e al CCR5, attivando le vie di segnalazione a valle che guidano la traslocazione della membrana GFP-GLUT4.

Nei neuroni knockout CCR5, CCL5 non riesce a legarsi, con conseguente riduzione della traslocazione GFP-GLUT4.

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