Imaging dell'attivazione neuronale dell'ippocampo nelle sezioni del cervello del topo

Inizia con sezioni cerebrali di topo che espongono l'ippocampo dorsale, ricco di neuroni.

Aggiungi perossido di idrogeno per estinguere l'attività della perossidasi neuronale, seguito dal lavaggio.

Tratta con un tampone di permeabilizzazione, poi applica un tampone di blocco per bloccare il legame non specifico.

Aggiungi gli anticorpi primari e incuba con agitazione. Questi anticorpi si legano alle proteine marcatrici di attivazione neuronale.

Lava e applica anticorpi secondari coniugati con biotina per legare gli anticorpi primari.

Risciacqua e introduci un complesso avidina-biotina-perossidasi che si lega alla biotina sui coniugati.

Lava di nuovo, poi aggiungi un substrato cromogenico, che viene ossidato dalla perossidasi per generare un precipitato marrone. Ferma la reazione con PBS.

Trasferisci le sezioni su un vetrino rivestito di gelatina e disidratale usando concentrazioni crescenti di etanolo. Quindi, elimina le sezioni in xilene e montale.

Posiziona il vetrino sotto un microscopio a campo chiaro.

Sotto l'illuminazione leggera, le regioni non colorate trasmettono luce e appaiono luminose, mentre i neuroni colorati assorbono e riflettono la luce e appaiono più scuri.

L'area più scura distinta indica l'attivazione neuronale all'interno dell'ippocampo.

Trasferire da tre a cinque sezioni ippocampali dorsali per ciascun topo nei pozzetti di una piastra da 24 pozzetti multipli contenente 500 microlitri di PBS molare 0,1 per ciascun pozzetto. Lavare le sezioni contenute in ogni pozzetto con 500 microlitri di PBS 0,1 molare. Eseguire tutti i lavaggi e le incubazioni a temperatura ambiente con una leggera agitazione, se non diversamente specificato. Sotto una cappa aspirante, incubare le sezioni in metanolo al 40% e perossido di idrogeno all'1% in PBS molare 0,1 per 20 minuti al fine di estinguere l'attività della perossidasi endogena.

Dopo altri tre lavaggi in PBS 0,1 molare, permeabilizzare le sezioni incubandole in 500 microlitri di Triton X-100 allo 0,2% per cinque minuti. Mentre le sezioni sono in incubazione, preparare una quantità sufficiente di tampone di blocco per l'intero esperimento. Quindi, rimuovere la soluzione di permeabilizzazione e aggiungere 100 microlitri di tampone bloccante a ciascun pozzetto. Incubare le sezioni per un'ora.

Successivamente, rimuovere il tampone bloccante e coprire le sezioni con l'anticorpo primario chinasi regolata extracellulare fosforilata, diluito da 1 a 500 in tampone bloccante. Incubare le sezioni per una notte a 4 gradi Celsius con una leggera agitazione. Il giorno successivo, dopo aver lavato le sezioni tre volte in PBS 0,1 molare per 5 minuti ciascuna, incubare le sezioni con un anticorpo secondario coniugato con biotina diluito in tampone bloccante da 1 a 250 per un'ora a temperatura ambiente.

Durante l'incubazione, preparare il reagente ABC almeno 30 minuti prima dell'uso per lasciare il tempo sufficiente per la formazione del complesso avidina e biotina. Dopo aver lavato le sezioni altre tre volte con PBS 0,1 molare, aggiungere il reagente ABC e lasciarlo incubare con il campione per 45 minuti. Durante la successiva serie di tre lavaggi in PBS, preparare la soluzione di lavoro per tamponare nella cappa aspirante secondo le specifiche del produttore. Aliquotare la soluzione di lavoro nella piastra.

Quindi, trasferire le sezioni nei pozzetti contenenti la soluzione di lavoro DAB e far roteare lentamente la piastra per consentire la massima esposizione delle sezioni alla soluzione. Monitorare la reazione DAB su un microscopio fino a quando non si sviluppa un segnale adeguato in circa due-cinque minuti. Arrestare la reazione all'intensità di colore desiderata lavando il tessuto in PBS 0,1 molare. Dopo altri tre lavaggi in PBS, montare le sezioni su vetrini rivestiti di gelatina e asciugarle a temperatura ambiente per almeno tre o quattro ore.

Una volta asciugati all'aria, trasferire i vetrini nella cappa aspirante e disidratare le sezioni mettendole in sequenza in soluzioni di etanolo graduato per due minuti ciascuna. Quindi, eliminare i vetrini in xileni al 100% per cinque minuti. Scivolare i vetrini utilizzando un mezzo di montaggio e lasciarli asciugare nella cappa aspirante per una notte.

Trasferire i vetrini su un microscopio a campo chiaro dotato di una fotocamera in obiettivo 20x. Acquisisci più immagini in campo chiaro da ciascuna sezione con un ingrandimento di 200x, coprendo l'ippocampo dorsale. Immagina da tre a cinque sezioni di ogni animale.