Imaging in vivo a due fotoni della retina del topo

Prendi un topo transgenico anestetizzato con la testa fissata ad angolo su un supporto per l'imaging in vivo della retina del topo.

La retina contiene cellule gangliari retiniche, o RGC, che esprimono una proteina marcata con fluoroforo.

Applica il lubrificante per gli occhi e monta un vetrino coprioggetti sopra l'occhio.

Sotto un microscopio, illumina uniformemente la retina per eccitare le proteine fluorescenti negli RGC.

Utilizzando la fluorescenza emessa, ottieni una visione a campo ampio delle RGC del piano focale e delle RGC fuori fuoco.

Passa alla modalità di imaging a due fotoni, focalizzando la luce del vicino infrarosso a bassa energia nello strato RGC.

Nel punto focale, l'energia combinata di due fotoni eccita il fluoroforo, che poi rilascia energia sotto forma di fluorescenza.

Poiché l'eccitazione è confinata a un singolo punto, la fluorescenza da altri piani focali è ridotta al minimo.

Cattura immagini su più piani focali lungo l'asse z per visualizzare l'intero livello RGC.

Applicare un collirio lubrificante su entrambi gli occhi del mouse. Ruotare il braccio principale del supporto per la testa fino a quando la pupilla di un occhio non è orientata in linea con il percorso della luce e posizionare un vetrino coprioggetti numero 1,5 nel portafiltro compatto. Dopo aver fissato il supporto al tavolino del microscopio, abbassare il vetrino coprioggetti fino a quando non tocca il lubrificante i-gel senza toccare la cornea. E regolare il tavolino nella dimensione xy e la posizione z dell'obiettivo fino a quando la luce di eccitazione a campo largo copre completamente la cornea.

Utilizzare l'oculare per continuare a regolare la posizione z, fino a quando le cellule o le strutture fluorescenti della retina non vengono messe a fuoco, aumentando l'illuminatore di epifluorescenza secondo necessità per risolvere singole cellule o strutture di interesse. Ottimizza l'allineamento della retina con il percorso della luce per l'imaging. Regolare l'angolo della testa fino a quando non si verifica solo l'espansione o la contrazione della luce sfocata quando si cambia il piano focale, riducendo al minimo le distorsioni xy.

Quindi spegnere l'illuminatore a epifluorescenza e chiudere l'otturatore dell'illuminatore. Per l'imaging a due fotoni, seguire tutti i protocolli di sicurezza laser istituzionali. Spegnere e coprire tutta la luce ambientale e commutare il percorso della luce di eccitazione verso il laser e il percorso della luce di emissione verso i PMT.

Nel software di acquisizione delle immagini, impostare la dimensione del fotogramma su 512 x 512 e la media del fotogramma su 3. Imposta lo z-stepping in modo che inizi dalla parte superiore della pila e progredisca verso il basso, riducendo al minimo l'attivazione laser a due fotoni dei fotorecettori. Accendere e abilitare i PMT e regolare la tensione a 680 volt.

Abilita gli otturatori di imaging ed emissione. Avvia un'anteprima dell'immagine dal vivo del tessuto target a partire da una potenza laser dell'1% e regola automaticamente la luminosità del display per visualizzare le cellule o le strutture di interesse. Se il tessuto bersaglio è debole o poco chiaro, aumentare la percentuale di potenza del laser fino a quando le strutture diventano visibili senza superare i 45 milliwatt.

Manovrare il tavolino del microscopio in direzione xy per centrare l'area di imaging desiderata e navigare verso il piano z, con le strutture di interesse a fuoco. Per un esperimento di time-lapse cronico, aprire un'immagine ottenuta in precedenza da utilizzare come riferimento per le cellule di interesse, facendo attenzione che l'angolo di imaging nell'immagine corrente sia simile a quello delle immagini precedenti. Quindi passare ai piani z superiore e inferiore di interesse per impostare i limiti z dello stack di immagini e acquisire l'immagine.