Imaging a fluorescenza delle dinamiche neuroimmunitarie utilizzando un impianto cranico

Inizia con un topo transgenico anestetizzato con una finestra circolare di imaging in vetro e una piastra per la testa impiantata sul suo cranio.

Le cellule microgliali o immunitarie e i neuroni sono marcati con proteine fluorescenti.

Poi, fissa il topo sul tavolino del microscopio a due fotoni.

Quindi, inietta un colorante fluorescente intraperitoneale per colorare i vasi sanguigni di rosso.

Pulisci la finestra di imaging in vetro, applica una goccia di soluzione salina e abbassa l'obiettivo del microscopio.

Quindi, imposta la luce laser per catturare un'immagine dei vasi sanguigni. Registra il modello di ramificazione e le coordinate per individuare e visualizzare la stessa regione in un secondo momento.

Ora, imposta il laser per eccitare le proteine fluorescenti, provocando la fluorescenza della microglia e dei neuroni.

Utilizzando il modello di ramificazione registrato, localizza la stessa regione e cattura regolarmente immagini di cellule.

La rete vascolare e i neuroni rimangono stabili, mentre i cambiamenti di posizione della microglia nel tempo riflettono le dinamiche immunitarie in risposta all'attività neuronale.

Praticare un'apertura circolare di circa 4 millimetri nel cranio utilizzando una punta da trapano dentale. Durante la perforazione, inumidire regolarmente il cranio con soluzione fisiologica sterile e tamponi di cotone per raffreddare il cervello. Elimina i detriti ossei e ammorbidisci l'osso del cranio.

Al termine, rimuovere con cura questa parte del cranio con una pinza appuntita. Dopo aver rimosso il cranio, posizionare con cura un piccolo vetro di copertura inumidito con soluzione fisiologica nella craniotomia. Asciugare la soluzione salina in eccesso con una salvietta sterile. Usando un applicatore appuntito, applica la colla cianoacrilica intorno alla finestra e lasciala attaccare al cervello e al cranio.

Applicare la colla di base sul resto del cranio e polimerizzarla con una lampada polimerizzante per 20-40 secondi. Crea un pozzetto intorno alla finestra con la colla finale e polimerizzalo con una lampada polimerizzante per 20-40 secondi. Incollare una piccola placca sulla testa sul cranio nell'emisfero controlaterale della craniotomia con la colla di base, e poi, con la colla finale, polimerizzare entrambi per 20-40 secondi.

Dopo che il topo si è svegliato, iniettare una dose sottocutanea di buprenorfina SR come analgesia post-operatoria, che sarà sufficiente per 72 ore. Fornisci al topo cibo extra morbido per facilitare un sano recupero. L'imaging può essere eseguito già due settimane dopo l'intervento di impianto. Utilizzare le viti per montare la piastra di testa sul tavolino del microscopio a due fotoni, che deve essere mantenuta a 35 gradi Celsius con una piastra riscaldante.

Iniettare nel topo per via sottocutanea 100 microlitri di colorante per vasi sanguigni, come la rodamina B. Pulire delicatamente la superficie della finestra cranica con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70%. Metti alcune gocce d'acqua o soluzione salina sulla finestra e abbassa la lente dell'obiettivo nella soluzione. Assicurarsi che il laser sia spento mentre l'obiettivo si sta abbassando.

Disegna a mano una mappa del percorso per indicare i principali punti di riferimento dei vasi sanguigni, mentre guardi attraverso l'oculare. Utilizzare questo disegno per identificare le regioni specifiche durante l'imaging di due fotoni. Raccogli immagini di cellule e vasi fluorescenti utilizzando l'imaging a due fotoni. Vedere il manoscritto del testo per i parametri di imaging. Prendi appunti accurati con le coordinate appropriate per assicurarti che le regioni precise possano essere rivisitate per l'imaging successivo.

Raccogli diversi campi visivi in questa sessione iniziale di imaging.