JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:48 min • May 29th, 2025
Inizia con una configurazione di microscopio a fluorescenza contenente un diaframma immobilizzato con nervi frenici di un topo transgenico.
La giunzione neuromuscolare del diaframma è costituita da un motoneurone, una fibra muscolare e cellule di Schwann contenenti recettori dell'acetilcolina e canali del calcio.
Queste cellule hanno recettori dell'acetilcolina marcati in fluorescenza ed esprimono indicatori intracellulari del calcio.
Uno splitter di immagini collegato alla configurazione consente la visualizzazione simultanea di entrambi i segnali fluorescenti.
Il nervo frenico è posizionato in un elettrodo di aspirazione per fornire uno stimolo elettrico.
Al microscopio a fluorescenza, visualizzare i recettori dell'acetilcolina per identificare una giunzione neuromuscolare.
Per impostare una fluorescenza massima di base, aggiungere una soluzione di cloruro di potassio per depolarizzare temporaneamente la membrana cellulare. Questo innesca l'afflusso intracellulare di calcio, causando un aumento della fluorescenza degli indicatori.
Regolare le impostazioni di luminosità per evitare la sovrasaturazione del segnale di fluorescenza.
Dopo la ripolarizzazione, applicare stimolazioni elettriche per innescare l'afflusso di calcio nella cellula e registrare il cambiamento nella fluorescenza intracellulare a un frame rate elevato.
A 20 volte l'ingrandimento, individuare la fascia della piastra terminale al centro del muscolo cercando le giunzioni neuromuscolari alfa-bungarotossina marcate in modo fluorescente sotto l'eccitazione della luce giallo verde. Passa all'eccitazione della luce blu per visualizzare le risposte del calcio nei muscoli, nei motoneuroni o nelle cellule di Schwann. In questo esempio, GCaMP 3 è espresso nelle cellule muscolari.
Se lo si desidera, impostare lo splitter di immagini con filtri passa-banda e filtro dicroico a bordo singolo per l'imaging a doppia lunghezza d'onda. Eseguire esperimenti con la barra della luminosità sulla barra della tabella di ricerca, impostata al 110% del livello al quale l'indicatore di calcio geneticamente codificato che esprime il tessuto mostra saturazione a 20 volte l'ingrandimento, senza binning in risposta al cloruro di potassio.
Registra a 20 fotogrammi al secondo per non perdere nessun evento veloce. Stimolare con 1-45 secondi di 20-40 hertz di stimolazione nervosa erogando un treno di impulsi utilizzando un elettrodo di aspirazione. E raccogliere risposte dinamiche fluorescenti di calcio in un sottotipo di cellula, insieme al segnale della giunzione neuromuscolare alfa-bungarotossina marcata in fluorescenza statica.