Imaging a diffusione Raman stimolato a due colori del tessuto cerebrale del topo

Prendi una fetta di cervello di topo all'interno di una camera su un vetrino e mettila sotto un microscopio con un sistema di imaging a diffusione Raman stimolato, o SRS.

Focalizza due raggi laser sincronizzati, noti come raggi di pompa e Stokes, sul tessuto.

La differenza di energia tra questi raggi corrisponde alla frequenza vibrazionale di molecole specifiche, indurre vibrazioni molecolari.

Eccitare i lipidi e le proteine dei tessuti, avendo vibrazioni molecolari uniche, utilizzando coppie di frequenza distinte dei fasci sincronizzati.

L'eccitazione facilita il trasferimento di energia tra i raggi, riducendo l'intensità del fascio di pompa e aumentando l'intensità del fascio di Stokes.

La variazione di intensità relativa viene rilevata come un segnale SRS che aiuta a identificare le molecole.

Un fotorivelatore raccoglie i segnali SRS combinati dal campione.

Assegna i segnali lipidici e proteici colori separati, creando un'immagine bicolore, per identificare le proteine e i lipidi nel tessuto cerebrale.

Posiziona un campionatore di raggio nel percorso del raggio di corsa per raccogliere il 10% del raggio. E inviarlo a un fotodiodo veloce per rilevare il treno di impulsi da 8 megahertz. Prendere una delle uscite del buffer di fanout e filtrarla con un filtro passa-banda per ottenere l'onda sinusoidale di 20 megahertz. Quindi, utilizzare un attenuatore RF per regolare la tensione da picco a picco di ingresso/uscita a circa 500 millivolt. Invia l'uscita risultante a uno sfasatore, che consente la regolazione fine della fase RF con una sorgente di tensione.

Inviare questa uscita a un amplificatore di potenza RF e collegare l'uscita dell'amplificatore all'EOM. Dopo aver sbloccato il fascio di corse, ottimizzare la profondità di modulazione della prima EOM posizionando un fotodiodo nel percorso del fascio. Regolare la tensione EOM e la piastra a quarto d'onda fino a quando la profondità di modulazione non appare soddisfacente. Posizionare un fotodiodo dopo lo specchio dicroico per rilevare il raggio laser. Blocca prima il raggio di corsa. Quindi, ingrandire uno dei picchi di impulso della pompa sull'oscilloscopio. Posizionare un cursore verticale per contrassegnare la posizione temporale di questo picco con l'oscilloscopio.

Ora, blocca la trave della pompa e sblocca la trave di Stokes. Traslare la fase di ritardo per far corrispondere temporaneamente le posizioni di picco sull'oscilloscopio alla posizione contrassegnata nel passaggio precedente calcolando la distanza di ritardo necessaria per abbinare i due raggi, quindi allungando il percorso del raggio più veloce o accorciando il percorso del raggio più lento.

Successivamente, preparare un campione di vetrino da microscopio con DMSO e nastro biadesivo come distanziatore per trattenere il campione tra il vetrino e un vetrino coprioggetti. Posizionare il campione sul microscopio con il lato del vetrino coprioggetti rivolto verso l'obiettivo del microscopio e osservare il campione dall'oculare in condizioni di illuminazione a campo chiaro. Trova il fuoco del campione sia nello strato superiore che in quello inferiore delle bolle d'aria all'interfaccia del nastro di vetro. Quindi, sposta la messa a fuoco in modo che si trovi tra i due strati del nastro.

Quindi, impostare l'ingresso/uscita del raggio sintonizzabile su 798 nanometri. In base alla portata ottica del condensatore, regolare la potenza ottica in modo che sia di circa 40 milliwatt ciascuno per la pompa e alimenta i raggi al fuoco dell'obiettivo. Quindi apri l'immagine di scansione in Matlab e fai clic sul pulsante con l'etichetta Focus per avviare la scansione. Regolare lo specchietto di sterzo prima dello scanner galvo per centrare il segnale CC sul display del canale 1.

Spostare lo stadio di ritardo motorizzato e osservare attentamente l'uscita di blocco visualizzata sul display del canale due. Infine, regolare il ritardo per massimizzare l'intensità del segnale CA. Regolare lo specchio dicroico per centrare il segnale SRS sul canale CA. Quindi, regolare la fase del blocco in amplifier per massimizzare il segnale.

Dopo aver montato il campione, farlo scorrere sul microscopio e regolare la potenza di entrambi i fasci a circa 40 milliwatt ciascuno al fuoco del campione, come dimostrato in precedenza, immagine a scansione aperta da Matlab. Quindi, trova il segnale SRS massimo scansionando lo stadio di ritardo corrispondente al picco Raman di 2913 centimetri inversi del DMSO.

Acquisire un'immagine SRS corrispondente al picco Raman di 2913 centimetri inversi del DMSO. Aprire l'immagine in ImageJ e selezionare una piccola area al centro dell'inquadratura. Utilizzare la funzione di misura per calcolare la media e la deviazione standard dei valori nell'area selezionata. Per la calibrazione dell'asse di frequenza, è possibile salvare una scansione iperspettrale con l'intervallo dello stadio di ritardo che copre i picchi Raman di 2.913 e 2.994 centimetri inversi del DMSO.

Quindi, salvare le posizioni del palco corrispondenti al set di dati iperspettrali. Esegui la regressione lineare per le posizioni del palco e gli spostamenti Raman a 2.913 e 2.994 centimetri inversi. Utilizzando l'equazione di regressione lineare, convertire le posizioni di ritardo nelle frequenze Raman corrispondenti. Per la calibrazione della risoluzione spettrale, stimare la posizione del tavolino in base alla posizione precedente con l'aumento della lunghezza del percorso ottico dovuto all'inserimento delle barre. Riallineare la sovrapposizione spaziale della trave a causa della leggera deviazione della trave quando vengono aggiunte barre di vetro.

Installare un divisore di fascio polarizzatore, una piastra a quarto d'onda e una seconda EOM nel percorso del fascio di colpi dopo la prima EOM. Scollegare l'ingresso del segnale dalla seconda EOM. Quindi, collegare l'ingresso del segnale alla prima EOM e accenderla. Modula il raggio di Stokes a megahertz inviando il raggio attraverso la prima EOM. Regolare l'inclinazione e la posizione della prima EOM per assicurarsi che il raggio sia centrato attraverso il cristallo EOM. Preparare un campione di fetta di tessuto con nastro biadesivo, vetrino da microscopio e vetro di copertura.

Posizionare il campione sul microscopio con il lato del vetrino coprioggetti rivolto verso l'obiettivo del microscopio. Per l'imaging SRS in modalità Epi, installare una piastra a semionda prima che il raggio entri nel microscopio per modificare la polarizzazione del raggio che entra nel microscopio. Posizionare un divisore di fascio polarizzatore sopra l'obiettivo per consentire al raggio retroriflesso depolarizzato di raggiungere il rilevatore.

Quindi, utilizzare una lente acromatica da 75 millimetri e una lente asferica da millimetri per trasmettere i fotoni retrodiffusi dall'apertura posteriore dell'obiettivo al fotorilevatore. Montare il rilevatore per raccogliere la luce retrodiffusa diretta dal divisore di fascio polarizzatore. Quindi installare un filtro per impedire al raggio modulato di entrare nel rivelatore.