JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:19 min • May 29th, 2025
Inizia con un tessuto ippocampale di topo ripulito reso otticamente trasparente rimuovendo i lipidi. Il tessuto è incorporato in una rete di idrogel per stabilizzare le biomolecole e preservare le strutture cellulari.
Il tessuto contiene astrociti che esprimono la proteina fluorescente rossa e neuroni eccitatori che esprimono la proteina nucleare verde, consentendo una visualizzazione distinta.
Posizionare il tessuto su un vetrino e creare una camera utilizzando la colla a caldo, lasciando un piccolo spazio vuoto.
Applicare una soluzione corrispondente all'indice di rifrazione per idratare il tessuto e prevenire la formazione di bolle, quindi sigillare con un vetrino coprioggetti.
Riempire la camera con una soluzione corrispondente all'indice di rifrazione per ridurre la dispersione della luce e chiudere lo spazio.
La
luce nel vicino infrarosso eccita le proteine fluorescenti rosse e verdi sul piano focale, consentendo immagini ad alta risoluzione con fotodanni minimi. Le emissioni di fluorescenza vengono rilevate separatamente, rivelando chiaramente la vicinanza spaziale tra gli astrociti e i nuclei dei neuroni eccitatori.
Per prima cosa, posiziona il campione al centro del vetrino. Utilizzando la colla a caldo, creare pareti sui bordi dello scivolo, alte quasi quanto il tessuto. Assicurati di lasciare un piccolo spazio in uno degli angoli. Quando lo strato di colla a caldo si avvicina all'altezza della fetta di cervello, applicare una o due gocce della soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione sul campione per inumidire la superficie superiore e prevenire la formazione di bolle.
Mentre la colla a caldo è ancora liquida, sigillare la parte superiore con un vetrino coprioggetti, posizionandolo il più uniformemente possibile. Quindi, riempire la camera con la soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione. Chiudi lo spazio con la colla a caldo. Se le pareti della colla a caldo si estendono oltre i bordi della diapositiva, tagliare i bordi di estensione. Se per l'imaging viene utilizzato un obiettivo a immersione in olio, aggiungere altri due o tre millimetri di colla alle pareti sopra il vetrino coprioggetti per trattenere la soluzione di immersione. Dopo questo protocollo, il tessuto cerebrale verrà eliminato.