Quantificazione dei neuroni appena generati nel tessuto cerebrale di ratto utilizzando la tecnica del frazionamento ottico

Prendi le fette di cervello dell'ippocampo da un ratto a cui è stata iniettata la bromodeossiuridina, o BrdU, un analogo nucleosidico della timidina.

BrdU si integra nel DNA durante la divisione cellulare, marcando i neuroni appena generati all'interno del giro dentato, una regione per la neurogenesi.

Incubare con un agente ossidante per inattivare gli enzimi perossidasi endogeni.

Trattare con acido per denaturare il DNA ed esporre BrdU, quindi neutralizzare l'acido.

Incubare con un detergente per permeabilizzare le membrane cellulari e una soluzione bloccante per mascherare i siti di legame non specifici.

Incubare con anticorpi primari che hanno come bersaglio BrdU, seguiti da anticorpi secondari marcati con perossidasi specifici per gli anticorpi primari.

Introdurre un substrato cromogenico e un agente ossidante, consentendo alla perossidasi di convertire il substrato in un residuo colorato.

Montare il tessuto e controcolorare con un colorante legante l'acido nucleico.

Disidratare il tessuto, quindi trattarlo per aumentare la trasparenza.

Al microscopio, identificare il giro dentato.

Utilizzando la tecnica del frazionamento ottico, analizza più piani attraverso lo spessore del tessuto per quantificare i neuroni marcati con BrdU.

Quando sono pronti per iniziare, l'immunocolorazione, lasciare che le sezioni raggiungano la temperatura ambiente. Quindi utilizzare un pennello per trasferire ogni quinta sezione da una serie di sezioni ippocampali a reti di colorazione a 25 pozzetti posizionate in piastre di Petri riempite con PBS. Dovrebbero esserci da 8 a 12 sezioni per ippocampo per la colorazione. Trasferire le reti coloranti, contenenti le sezioni, in piatti di vetro corrispondenti, contenenti PBS, e lavare le sezioni due volte per 10 minuti in PBS.

Quindi, incubare in perossido di idrogeno al 3% per 20 minuti. Dopo il lavaggio, spostare le sezioni attraverso tre soluzioni di acido cloridrico. Quindi, neutralizzare in tetraborato di sodio 0,1 molare a temperatura ambiente per 20 minuti.

Dopo tre incubazioni di 10 minuti in cambio del tampone di lavaggio, trasferire le sezioni in soluzione bloccante per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, incubare le sezioni in anti-BrdU di topo, diluito da 1 a 100 in soluzione bloccante per 48 ore a 4 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione dell'anticorpo primario, lavare tre volte per 10 minuti ciascuna in tampone di lavaggio, quindi incubare per 48 ore in perossidasi di rafano, diluita da 1 a 10 in tampone di lavaggio. 48 ore dopo, trasferire le sezioni in PBS per 10 minuti e ripetere per un totale di cinque lavaggi. Dopo il lavaggio, trasferire le sezioni nella soluzione DAB per sette minuti. Quindi, trasferire in una soluzione DAB contenente perossido di idrogeno allo 0,02% per 10 minuti.

Dopo una serie di lavaggi, montare le sezioni in ordine numerico sui vetrini del microscopio. Lasciare asciugare per circa 30 minuti. Quindi, asciugare i campioni all'aria mettendoli in un rack per vetrini. Successivamente, reidratare i campioni per 10 minuti in una capsula per la colorazione dei vetrini contenente acqua distillata.

Quindi, trasferire i vetrini allo 0,02% di cristallovioletto in acqua distillata per 15 minuti. Dopo aver ripetuto la colorazione cristallovioletta, reidratare le sezioni attraverso una serie di etanolo. Quindi, eliminare le sezioni in xilene due volte per 15 minuti ogni volta. Infine, aggiungere il mezzo di montaggio ad asciugatura rapida e vetrino coprioggetti i vetrini.

Dopo 24 ore, i vetrini possono essere utilizzati per la microscopia. Inizia controllando lo spessore del tessuto posizionando prima i vetrini sul tavolino motorizzato del microscopio, quindi aprendo il software di stereologia. Delinea l'area di interesse utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento prima di passare a un obiettivo a immersione in olio 100x.

Quindi, selezionare un punto specifico nel fotogramma di contabilità, ad esempio un'area adiacente a un angolo, e individuare la parte superiore della sezione spostandosi lungo il piano focale fino a quando una parte della sezione non appare a fuoco. Registra questa posizione z come 0. Quindi, sposta il piano focale verso il basso attraverso il tessuto fino a quando l'ultimo livello z di tessuto è a fuoco, quindi segna questa posizione. Lo spessore del tessuto locale è definito da 0 a questo punto finale e può essere letto sull'asse z.

Registrare lo spessore del tessuto. Lo spessore del tessuto viene misurato in diversi punti all'interno della regione di interesse. L'altezza del dissettore e delle zone di guardia, la dimensione del conteggio, l'inquadratura, la lunghezza del passo e l'ingrandimento finale sono determinati in uno studio pilota. Ora, puoi iniziare a contare i neuroni BrdU-positivi, di solito a un ingrandimento finale da 2.000 a 3.000x, usando un obiettivo a olio 60x o 100x e un'apertura numerica elevata.

Identifica i neuroni BrdU-positivi in ogni frame di conteggio, ma non contare quelli che toccano la linea di esclusione rossa. Conta quei neuroni BrdU-positivi che toccano la linea di inclusione verde e quelli che rientrano nel limite del frame di conteggio. Conta i neuroni BrdU-positivi solo quando la caratteristica di interesse è chiaramente riconosciuta all'interno dell'altezza del dissettore. I neuroni semi-visibili mostrati qui non vengono contati.