Quantificazione dei neuroni appena generati nel tessuto cerebrale di ratto utilizzando la tecnica del frazionamento ottico

Prendi le fette di cervello dell'ippocampo da un ratto a cui è stata iniettata la bromodeossiuridina, o BrdU, un analogo nucleosidico della timidina.

BrdU si integra nel DNA durante la divisione cellulare, marcando i neuroni appena generati all'interno del giro dentato, una regione per la neurogenesi.

Incubare con un agente ossidante per inattivare gli enzimi perossidasi endogeni.

Trattare con acido per denaturare il DNA ed esporre BrdU, quindi neutralizzare l'acido.

Incubare con un detergente per permeabilizzare le membrane cellulari e una soluzione bloccante per mascherare i siti di legame non specifici.

Incubare con anticorpi primari che hanno come bersaglio BrdU, seguiti da anticorpi secondari marcati con perossidasi specifici per gli anticorpi primari.

Introdurre un substrato cromogenico e un agente ossidante, consentendo alla perossidasi di convertire il substrato in un residuo colorato.

Montare il tessuto e controcolorare con un colorante legante l'acido nucleico.

Disidratare il tessuto, quindi trattarlo per aumentare la trasparenza.

Al microscopio, identificare il giro dentato.

Utilizzando la tecnica del frazionamento ottico, analizza più piani attraverso lo spessore del tessuto per