Monitoraggio del recupero delle cellule interneuromast ablate con laser in zebrafish mediante microscopia confocale

Iniziare con una larva di zebrafish contenente cellule interneuromastali o INMC marcate in modo fluorescente, montate su un vetrino coprioggetti e poste sotto un microscopio confocale.

Le INMC sono cellule progenitrici con capacità rigenerativa che sono state precedentemente sottoposte ad ablazione laser.

Innanzitutto, osserva l'area danneggiata in modalità fluorescenza. L'assenza di fluorescenza conferma il successo dell'ablazione laser.

Successivamente, utilizzare la modalità di imaging a luce trasmessa per esaminare l'area danneggiata in cui la cellula appare granulare e gonfia con nuclei irregolari, confermando la morte cellulare.

Il reclutamento di macrofagi nel sito indica una risposta cellulare attiva al danno.

A questo punto, è possibile tornare alla modalità di fluorescenza e acquisire immagini time-lapse a intervalli regolari per monitorare il recupero.

Durante la fase di recupero, gli INMC estendono le proiezioni nello spazio, facilitando la chiusura e promuovendo la riparazione cellulare.

Salvate queste immagini di serie temporali per l'analisi. La ricomparsa di una fluorescenza distinta nell'area ablata conferma il successo del recupero cellulare.

Per l'imaging dei corpi cellulari dopo l'ablazione, nel menu Canali, deselezionare la traccia DAPI per disattivare il laser di ablazione e aprire il menu della modalità di acquisizione. Fare clic su Zoom e ridurre lo zoom a 0,7.

Per valutare il successo dell'ablazione cellulare, eseguire una scansione rapida del campo visivo. Utilizzando le stesse impostazioni di quelle per l'imaging pre-ablazione, acquisire e salvare un'immagine post-ablazione. Ispezionare l'immagine del canale del tubo fotomoltiplicatore a luce trasmessa per confermare ulteriormente il danno cellulare. Le cellule danneggiate dimostreranno un aspetto granulare e i nuclei si gonfieranno frequentemente o appariranno di forma irregolare.

Per valutare il recupero del corpo cellulare post-ablazione, attivare sia la posizione del tavolino che le opzioni temporali per l'acquisizione di immagini time lapse e impostare i parametri temporali sul punto temporale sperimentale appropriato e sugli intervalli di 15 minuti. Avviare quindi l'esperimento per acquisire le immagini e salvare il file risultante al termine.