JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:41 min. • May 29th, 2025
Prendiamo una coltura neuronale ippocampale di ratto a breve termine che rappresenta i neuroni giovani e una cultura a lungo termine che rappresenta i neuroni invecchiati.
I neuroni invecchiati mostrano una maggiore densità di canali del calcio voltaggio-dipendenti di tipo L, o L-VGCC, che rimangono aperti per una durata più lunga dopo la depolarizzazione della membrana.
Incubare con un indicatore di calcio fluorescente che si diffonde nelle cellule, quindi lavare per rimuovere il colorante in eccesso.
Posizionare le colture in una camera di perfusione al microscopio a fluorescenza.
Introdurre una soluzione contenente neurotrasmettitori che si legano ai recettori sui neuroni, inducendo l'afflusso di ioni sodio e innescando la depolarizzazione della membrana.
La depolarizzazione attiva gli L-VGCC, consentendo l'afflusso di calcio nel citoplasma.
Nella coltura a lungo termine, la maggiore densità e l'apertura prolungata degli L-VGCC portano al sovraccarico di calcio, un segno distintivo dell'invecchiamento neuronale.
Il legame del calcio all'indicatore genera fluorescenza, con neuroni invecchiati che mostrano una maggiore intensità di fluorescenza, riflettendo un aumento dei livelli di calcio intracellulare dopo la stimolazione.
In questa procedura, incubare le cellule con Fura2-AM per 60 minuti a temperatura ambiente al buio, quindi trasferire i vetrini coprioggetti nella camera di perfusione. Successivamente, posizionare la camera di perfusione con il vetrino coprioggetti nel supporto del microscopio invertito. Selezionare il campo microscopico e perfondere continuamente le celle con HBS preriscaldato.
Successivamente, epi-illuminare le celle a 340 e 380 nanometri, quindi registrare la luce emessa a 520 nanometri ogni 5-10 secondi con una fotocamera a fluorescenza, che viene filtrata da uno specchio dicroico Fura-2. Per analizzare le immagini fluorescenti registrate. Innanzitutto, apri il file dell'esperimento.
Utilizzando il software AquaCosmos, fare clic su Rapporto e selezionare l'intervallo di rapporto desiderato. Calcola il rapporto pixel per pixel nelle immagini risultanti per ottenere una sequenza di immagini con rapporto. Quindi sottrai lo sfondo regolando il pulsante di illuminazione dello sfondo. Successivamente, premi Avvia calcolo. quindi, premi il pulsante Sequenza di tutti i tempi e cancella le vecchie ROI.
Per l'analisi quantitativa delle singole cellule, stabilire nuove ROI o le ROI corrispondenti ai singoli neuroni. Per rappresentare graficamente le singole registrazioni, esportare i valori di fluorescenza del rapporto corrispondenti a ciascun ROI nel programma di laboratorio di origine facendo clic su Grafico. Quindi fare clic su Calcola e salvare il file TXT. Successivamente, effettuare il calcolo corrispondente per stimare l'entità dell'aumento del rapporto di fluorescenza in risposta a ciascuna stimolazione.