JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
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Inizia con sezioni cerebrali da un modello murino neurodegenerativo.
Incuba con una soluzione bloccante integrata con detergente per aumentare la permeabilità tissutale e bloccare il legame non specifico. Scartare la soluzione.
Introdurre anticorpi primari mirati alle placche di amiloide-beta. Incubare con agitazione per gli anticorpi che interagiscono con le placche di amiloide-beta, quindi lavare.
Aggiungere anticorpi secondari rossi marcati con fluoroforo e incubare al buio per consentire agli anticorpi di interagire.
Lavare per rimuovere gli anticorpi non legati, seguito da un lavaggio con alcol.
Aggiungere la curcumina, che lega gli amiloidi ricchi di fogli beta con un'elevata affinità, quindi lavare.
Successivamente, trattare con concentrazioni crescenti di alcol, disidratando le sezioni cerebrali. Aggiungere xilene per rimuovere eventuali tracce di reagenti.
Montare una sezione su un vetrino e osservare al microscopio a fluorescenza.
Utilizzare un laser con lunghezza d'onda di 590 nanometri per eccitare i fluorofori rossi sugli anticorpi secondari. Cattura l'immagine.
Passa a un laser con lunghezza d'onda di 480 nanometri per eccitare la curcumina, emettendo fluorescenza verde.
Sovrapponi le immagini; la colocalizzazione della fluorescenza rossa e verde conferma la placca amiloide-beta nel tessuto cerebrale.
Per l'etichettatura di campioni sezionati con criostato con anticorpi anti-A beta, lavare i campioni tre volte con PBS fresco per lavaggio in pozzetti individuali di una piastra a 12 pozzetti prima di bloccare qualsiasi legame aspecifico con il 10% di siero di capra normale in PBS e lo 0,5% di Triton x-100 per un'ora a temperatura ambiente.
Al termine dell'incubazione, scartare la soluzione bloccante e incubare i campioni con l'anticorpo beta specifico A durante la notte a 4 gradi Celsius e 150 rotazioni al minuto. La mattina successiva, lavare le sezioni con tre lavaggi di 10 minuti in PBS fresco per lavaggio, seguiti da incubazione con un anticorpo secondario appropriato coniugato con un fluoroforo rosso per un'ora a temperatura ambiente al riparo dalla luce.
Al termine dell'incubazione, lavare le sezioni tre volte con PBS seguito da un lavaggio con alcool al 70%. Dopo il lavaggio con alcol, incubare le sezioni con 10 micromolari di curcumina per 10 minuti a temperatura ambiente seguiti da tre lavaggi con alcol al 70% di un minuto.
Dopo l'ultimo lavaggio, disidratare le sezioni con alcol al 90% e al 100% per un minuto per concentrazione e pulire le sezioni due volte per cinque minuti per immersione con xilene fresco per incubazione. Quindi montare e creare l'immagine delle sezioni come dimostrato.