Visualizzazione tridimensionale di un'infezione da virus della rabbia nel tessuto cerebrale del topo

Prendi una sezione fissa di cervello spesso da un topo infetto dal virus della rabbia.

Il virus infetta i neuroni e si replica, dando luogo alle proteine virali presenti all'interno delle cellule.

Trattare con un detergente per permeabilizzare le membrane cellulari e una soluzione bloccante per mascherare i siti di legame aspecifici.

Incubare con anticorpi primari che hanno come bersaglio le proteine virali, seguiti da anticorpi secondari coniugati con fluorofori che si legano agli anticorpi primari.

Trattare con un colorante fluorescente legante l'acido nucleico per marcare il nucleo.

Disidratare il tessuto aumentando le concentrazioni di alcol, quindi applicare una soluzione schiarente per aumentare la trasparenza dei tessuti per l'imaging.

Montare la sezione in una camera di imaging, riempirla con la soluzione di chiarificazione e sigillarla.

Utilizzando la microscopia a scansione laser confocale, è possibile visualizzare il tessuto separatamente utilizzando le etichette fluorescenti, quindi unirle per creare un'immagine bidimensionale.

Acquisisci immagini su diversi piani focali del tessuto e combinale per generare una rappresentazione tridimensionale per valutare la progressione dell'infezione.

Per l'immunocolorazione delle sezioni di tessuto cerebrale, lavare i campioni due volte per 1 ora in 4 millilitri di Triton X-100 allo 0,2% in PBS, seguiti da permeabilizzazione per due giorni a 37 gradi Celsius, in 4 millilitri di Triton X-100 allo 0,2%, dimetilsolfossido al 20% e glicina molare allo 0,3% in PBS. Bloccare qualsiasi legame aspecifico con 4 millilitri di Triton X-100 allo 0,2%, dimetilsolfossido al 10% e siero normale al 6% in PBS per due giorni a 37 gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione bloccante, etichettare i campioni con 2 millilitri di soluzione di anticorpi primari per cinque giorni a 37 gradi Celsius, rinfrescando la soluzione di anticorpi dopo due giorni e mezzo. Successivamente, lavare i campioni per un giorno in 4 millilitri di Tween 0,2% tra 20 e 10 microgrammi per millilitro di eparina in PBS, sostituendo il tampone di lavaggio almeno quattro o cinque volte nel corso della giornata e lasciando il lavaggio finale durante la notte.

Il giorno successivo, incubare i campioni in 2 millilitri di soluzione di anticorpi secondari per cinque giorni a 37 gradi Celsius. Quindi, lavare i campioni in 4 millilitri di eparina fresca allo 0,2% tra 20 e 10 microgrammi per millilitro di eparina in PBS, come dimostrato.

Per la colorazione nucleare dei campioni, incubare i campioni in 4 millilitri della colorazione dell'acido nucleico TO-PRO-3 per 5 ore, al riparo dalla luce. Al termine dell'incubazione, lavare i campioni in Tween 0,2% tra 20 e 10 microgrammi per millilitro di eparina in PBS come dimostrato, seguito da disidratazione in una serie di terz-butanolo ascendente per 2 ore per immersione.

Dopo l'immersione al 90%, trasferire i campioni in una soluzione di terz-butanolo al 96% durante la notte. La mattina successiva, disidratare ulteriormente i campioni in terz-butanolo al 100% per 2 ore prima di eliminare le sezioni di tessuto in BABB-D15 appena preparato per 2-6 ore fino a quando non sono otticamente trasparenti. I campioni possono quindi essere conservati in BABB-D15, al riparo dalla luce fino al loro montaggio e all'imaging.

Per il montaggio del campione, utilizzare una stampante 3D per stampare una camera di imaging e un coperchio. Montare un vetrino coprioggetti di 30 millimetri di diametro sulla camera di imaging con un componente di gomma siliconica vulcanizzante a temperatura ambiente. Allo stesso modo, montare un vetrino coprioggetti da 22 millimetri sul coperchio. Utilizzare un batuffolo di cotone bagnato con acqua per rimuovere la gomma siliconica in eccesso su entrambi gli anelli prima di lasciare che la gomma si indurisca durante la notte.

Il giorno successivo, posizionare un campione nella camera di imaging e aggiungere un piccolo volume di BABB-D15 alla camera prima di inserire il coperchio. Utilizzando un ago ipodermico, riempire la camera con BABB-D15 attraverso l'ingresso e tappare l'ingresso prima di sigillare la camera di imaging con gomma siliconica.

Per impostare l'acquisizione dell'immagine, selezionare le linee laser appropriate per i fluorofori utilizzati e regolare i campi di rilevamento di ciascun rivelatore per evitare la sovrapposizione del segnale tra i canali. Quindi imposta i parametri di acquisizione, definisci il bordo superiore e inferiore della pila e acquisisci la pila di immagini.

Per generare proiezioni 3D della pila di immagini, apri i file immagine nelle Figi e seleziona Immagine, Colore, strumento Canali, Altro e Dividi canali per dividere le immagini unite in singoli canali. Per la correzione dello sbiancamento delle immagini per ciascun canale, selezionare Immagine, Regola, Correzione sbiancamento e selezionare Rapporto semplice. Utilizzare i cursori per regolare la luminosità e il contrasto per ciascun canale e selezionare Immagine, Colore e Unisci canali. Spunta l'opzione Crea composito.

Converti l'immagine in formato RGB e seleziona Immagine, Pile e progetto 3D per generare una proiezione 3D. Seleziona il punto più luminoso come metodo di proiezione e imposta la spaziatura delle sezioni in modo che corrisponda alla dimensione del passo Z della pila di immagini acquisita. Per ottenere la massima qualità, impostare l'incremento dell'angolo di rotazione su 1 e abilitare l'interpolazione. Modificare la rotazione totale, le soglie di trasparenza e l'opacità in base alle esigenze. Quindi salva la proiezione 3D come entrambi. Formati di file TIFF e .AVI.