Visualizzazione delle proiezioni dei motoneuroni e della ramificazione degli assoni mediante microscopia a fluorescenza a foglio di luce

Prelevare un segmento di tessuto chimicamente fissato e cancellato da un embrione di topo transgenico che esprime la proteina fluorescente verde (GFP) nei motoneuroni spinali.

Montare il fazzoletto verticalmente su un puntale per pipetta modificato.

Fissare la punta a un capillare fissato all'interno del microscopio a fluorescenza a foglio luminoso.

Posizionare una camera del campione riempita di tampone sotto il tessuto per immergerlo e rimuovere i detriti.

Utilizzando il software di imaging, allineare il tessuto nel percorso della luce.

La

sorgente luminosa emette un sottile foglio di luce laser, eccitando le GFP su un singolo piano del tessuto per emettere fluorescenza.

Un rivelatore posizionato perpendicolarmente al percorso della luce cattura la fluorescenza emessa.

Acquisire immagini dei motoneuroni spinali per generare una ricostruzione 3D della morfologia delle ramificazioni assonali.

Utilizza il software per mappare gli assoni, identificando i modelli di ramificazione e gli endpoint per valutare la crescita e la connettività dei motoneuroni.

Imposta ottiche di illuminazione 5X/0,1 e ottiche di rilevamento 5X/0,16. Assemblare il portacampioni e il capillare del campione. Preparare la camera del campione riempiendola con una soluzione chiarificante. Per montare l'embrione, preparare una punta per pipetta P200 tagliando la parte superiore in modo che si adatti al diametro del capillare e rimuovere la parte appuntita per l'attacco del campione.

Quindi, sciogliere l'estremità smussata del puntale della pipetta usando una piccola fiamma. Spegni la fiamma e attacca rapidamente l'embrione verticalmente all'estremità fusa. Inserire la parte superiore della punta della pipetta con il capillare del campione e inserire la camera del campione preparata nel microscopio. Utilizzando il software di imaging, selezionare Individua capillare nella scheda Individua e regolare gli assi xy e z.

Quindi, seleziona Individua campione e ingrandisci su 0,6X per mettere a fuoco l'embrione. Lasciare che il tampone della camera si equilibri con l'embrione per un po' di tempo per eliminare eventuali detriti o bolle. Per l'acquisizione di immagini nella scheda Acquisizione, definire i parametri del percorso della luce, come gli obiettivi di rilevamento, il filtro di blocco laser, il divisore di raggio, le telecamere e i laser.

Selezionare la casella di controllo scansione pivot per la riduzione delle ombre. Quindi, definire le impostazioni di acquisizione, profondità di bit a 16 bit. Zoomate nell'intervallo tra 0,36 e 0,7X, illuminazione su un lato o su due lati. Fare clic su Continuo e impostare l'intensità del laser, il tempo di esposizione, la potenza del laser e la posizione del foglio luminoso. Successivamente, premere stop per terminare l'acquisizione dell'immagine.

È importante assicurarsi che il campione trasparente sia posizionato all'interno del percorso luminoso più breve per consentire l'acquisizione dettagliata di immagini di strutture verticali sottili sui singoli nervi motori.

Per l'acquisizione multidimensionale, definire la pila Z spostando la posizione Z per la prima e l'ultima immagine. Fare clic su Ottimale per impostare il numero della sezione. Quindi, fai clic su Avvia esperimento per acquisire lo stack Z selezionato. Al termine, salva l'immagine in formato punto CZI.

Per quantificare l'arborizzazione degli assoni, aprire il file immagine nel software di analisi delle immagini. Regola il colore, la luminosità e il contrasto dell'immagine utilizzando la finestra di regolazione del display per rilevare i filamenti in base al contrasto dell'intensità locale. Quindi, fai clic sull'icona Aggiungi nuovi filamenti e seleziona l'algoritmo del percorso automatico nel menu a discesa. Selezionare la regione di interesse.

Quindi, definisci i punti di partenza e di partenza assegnando le misure di diametro più grandi e sottili, che possono essere misurate utilizzando la modalità fetta. Assegna un punto iniziale al bordo della regione di interesse. Per ottenere l'aggiunta o la rimozione manuale dei punti iniziali, modificare innanzitutto la modalità del puntatore, Naviga selezione, quindi MAIUSC e fare clic con il pulsante destro del mouse sui punti di interesse.

Quindi, selezionare Soglie manuali per punti di partenza per assicurarsi che tutti gli arbori visibili siano contrassegnati. Quindi, aggiungi o rimuovi manualmente i punti di partenza. Seleziona la casella Rimuovi segmenti disconnessi e rimuovi i punti di partenza attorno ai punti iniziali. Successivamente, regolare la soglia per la sottrazione dello sfondo e terminare il processo.

È necessario rimuovere gli artefatti di fondo e confermare che il percorso del rivelatore rifletta la vera arborizzazione degli assoni per una quantificazione accurata.

Alla fine, scegli lo stile e il colore desiderati. Nella scheda Statistiche, selezionare dettagliato e utilizzare i punti terminali dei dendriti del numero di filamento per quantificare i terminali nervosi motori come indicatore dell'arborizzazione dell'assone motorio. Quindi, esporta l'immagine dell'assone ricostruito come file . file TIFF.