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Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:34 min • May 29th, 2025
Inizia con sezioni tangenziali prefissate delle sezioni corticali cerebrali appiattite. Lavare per rimuovere le tracce fissative.
Colorare le sezioni con una soluzione di diaminobenzidina o DAB e solfato di nichel-ammonio.
Il DAB si diffonde nei neuroni corticali e reagisce con la citocromo ossidasi nei mitocondri, formando un precipitato scuro. Il solfato di nichel-ammonio scurisce il precipitato, migliorando il contrasto.
Aggiungere paraformaldeide per fermare la reazione di colorazione, quindi risciacquare.
Montare le sezioni su un vetrino e disidratarle con lavaggi a base di etanolo.
Risciacquare con isopropanolo e xilene per liberare la sezione e migliorare la trasmissione della luce.
Applicare un mezzo di montaggio e applicare un vetrino coprioggetti.
Quando vengono ripresi con un microscopio a campo chiaro, all'interno dei neuroni corticali, i precipitati assorbono e diffondono la luce, facendoli apparire scuri.
Al contrario, le aree non colorate e pulite trasmettono la luce e appaiono luminose.
Questo contrasto evidenzia i moduli corticali come strutture scure e irregolari su uno sfondo più chiaro, che rappresentano cluster neurali attivi coinvolti nell'elaborazione delle informazioni sensoriali.
Lavare il tessuto della sezione in tampone HEPES per 15 minuti agitando delicatamente. Durante il lavaggio, preparare una nuova soluzione colorante con citocromo ossidasi e aggiungere il componente DAB appena prima di utilizzarlo. Ora, incubare le sezioni nella soluzione colorante appena preparata a temperatura ambiente con l'agitatore. E vegliate. A seconda della quantità di fissazione, la colorazione potrebbe essere osservabile in 10 minuti o potrebbe richiedere diverse ore.
Se la reazione è troppo lenta, aumentare la temperatura a 37 gradi Celsius. Per fermare la reazione, trasferire le sezioni in un bagno di PFA al 4% e lasciarle incubare per 15 minuti con una leggera agitazione. Quindi, lavare le sezioni tre volte con tampone HEPES per 10 minuti per lavaggio.
A questo punto, montare e asciugare le sezioni su vetrini e disidratarle con bagni di etanolo progressivamente più forti. Quindi, lavare i vetrini in isopropanolo per 5 minuti, seguito da xilene per cinque minuti. Dopo il bagno di xilene, aggiungere immediatamente un mezzo di montaggio non a base d'acqua a indurimento rapido. I mezzi a base d'acqua degraderanno la macchia. Dopo aver aggiunto un vetrino coprioggetti, conservare i vetrini a 4 gradi Celsius fino a quando non vengono ripresi.