JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 4:38 min • May 29th, 2025
Prendere le cellule isolate dai nervi sciatici di topo e dai gangli della radice dorsale o DRG.
Incubare con anticorpi marcati con fluorofori contro CD45 e CD11b e con anticorpi marcati con biotina contro MHC di classe II, per marcare le cellule immunitarie.
Incubare con streptavidina marcata con fluoroforo che si lega alla biotina.
Trattare con un fissativo per stabilizzare la struttura cellulare.
Introdurre un tampone di permeabilizzazione con una colorazione fluorescente del DNA per permeabilizzare le membrane ed etichettare i nuclei.
Utilizzando un citometro a flusso, far passare le cellule attraverso il raggio laser per valutare le caratteristiche ottiche e di fluorescenza.
Rimuovere gli aggregati con una maggiore fluorescenza del DNA per isolare le singole cellule e rilevare la fluorescenza dai marcatori.
Identificare le cellule che esprimono CD45, un marcatore caratteristico delle cellule immunitarie, confermandone la presenza.
La maggior parte delle cellule CD45-positive nel DRG esprimono CD11b e MHC di classe II, indicando cellule simili alla microglia, che sono assenti nei nervi sciatici.
Questa tecnica integra l'imaging per l'analisi dell'eterogeneità delle cellule immunitarie all'interno dei tessuti nervosi.
Al computer, selezionare i canali appropriati per il rilevamento dei fluorofori di interesse, la velocità di flusso appropriata per i campioni e il numero totale di eventi da raccogliere per campione. Il numero minimo di eventi dovrebbe essere di 1 milione.
Quindi, crea grafici a dispersione in un foglio di lavoro globale della dispersione laterale A rispetto alla dispersione diretta A, nonché per ogni fluoroforo di interesse rispetto alla dispersione diretta A. Inoltre, crea una vista statistica che visualizzerà il numero di eventi e l'intensità media della fluorescenza per i fluorofori selezionati.
Determinare il gate padre P1 in base al grafico a dispersione dei controlli di colorazione solo DAPI. Allegare il campione alla citometria a flusso e fare clic su Acquisisci. Osservare il grafico DAPI rispetto a FSC e ridurre la tensione del canale del DNA Pacific Blue fino a quando la popolazione DAPI-plus diventa visibile. Utilizzando lo strumento di controllo rettangolare, disegna un riquadro attorno alla popolazione DAPI-plus. Questo rappresenta il gate P1. Selezionare i grafici a dispersione per ciascuno dei fluorofori e visualizzare solo gli eventi DAPI-plus. Questo rappresenta la fluorescenza di fondo per ciascuno dei fluorofori.
Utilizzando lo strumento di iniezione rettangolare, disegnare una casella nei grafici a dispersione per ciascuno dei fluorofori, a partire da 103 sull'asse y. Questa porta rappresenta la regione in cui dovrebbero essere trovati gli eventi positivi per ciascuno dei marcatori indicati. Regolare le tensioni per ciascuno dei fluorofori utilizzando i controlli di colorazione solo DAPI. Allegare il campione alla citometria a flusso e fare clic su Acquisisci.
Osservare la posizione della popolazione DAPI-plus per ciascuno dei fluorofori e regolare le rispettive tensioni in modo che le popolazioni cadano al di fuori del gate rettangolare. Una volta configurato il citometro a flusso, eseguire i campioni ed esportare i file di dispersione diretta per ulteriori analisi.